¿Cómo elegir un sistema de imágenes de fluorescencia para animales pequeños?
En comparación con la tecnología tradicional, la tecnología de imágenes de fluorescencia in vivo no requiere el sacrificio de animales y puede rastrear e fotografiar repetidamente al mismo animal durante mucho tiempo, lo que no solo mejora la comparabilidad de los datos, sino también Evita el impacto de las diferencias individuales en los resultados de las pruebas. También puede comprender la distribución y el metabolismo de los marcadores en animales, evitando muchas deficiencias de los métodos experimentales in vitro tradicionales, en particular, también puede utilizar métodos ecológicos originales para estudiar problemas, es decir, no es necesario etiquetar los objetos de investigación primero; , y luego utiliza etiquetas fluorescentes para estudiar su comportamiento y las observaciones son reales y confiables.
Entonces, ¿cómo elegir el sistema de imágenes de fluorescencia in vivo más adecuado? Este artículo intenta analizar desde los siguientes puntos.
1. Selección de etiquetas fluorescentes
Existen tres métodos de etiquetado principales para la tecnología de imágenes de fluorescencia in vivo: etiquetado de proteínas fluorescentes, etiquetado de tintes fluorescentes y etiquetado de puntos cuánticos. Las proteínas fluorescentes son adecuadas para marcar células tumorales, virus, genes, etc. Los más utilizados incluyen GFP, e GFP, RFP (DsRed), etc. El método de etiquetado de los tintes fluorescentes es el mismo que el in vitro, como Cy3, Cy5, Cy5.5 y Cy7, que se pueden utilizar para marcar anticuerpos, péptidos, fármacos de molécula pequeña, etc. Como nuevo método de etiquetado, el etiquetado de puntos cuánticos tiene una intensidad de emisión 20 veces mayor que la de los tintes fluorescentes orgánicos y una estabilidad superior a 100 veces. Tiene las ventajas de un espectro de fluorescencia estrecho, un alto rendimiento cuántico, no es fácil de blanquear, un amplio espectro de excitación, un color ajustable, una alta estabilidad fotoquímica y no es fácil de descomponer. Los puntos cuánticos son nanocristales semiconductores que emiten fluorescencia, con un tamaño inferior a 100 nm. Puede soportar excitaciones repetidas y no es tan susceptible a la extinción de la fluorescencia como los tintes fluorescentes orgánicos.
Sin embargo, la penetración tisular de diferentes longitudes de onda de fluorescencia es diferente. Como se muestra en la Figura 1, la transmitancia de luz de varias longitudes de onda a varios órganos de ratones aumenta significativamente cuando la longitud de onda es >: 600 nm. Sin embargo, como se muestra en la Figura 2, en el rango del infrarrojo cercano de 650 nm a 900 nm, la absorción de luz en estas longitudes de onda por la hemoglobina, la grasa y el agua sigue siendo relativamente baja. Por lo tanto, elegir marcadores fluorescentes del infrarrojo cercano con espectros de excitación y emisión dentro del rango de 650 nm a 900 nm (o al menos el espectro de emisión dentro de este rango) es más propicio para la obtención de imágenes ópticas in vivo, especialmente las imágenes fluorescentes de tejidos profundos. (Literatura recomendada: Nature Method, 2005, 2: 12 Cómo elegir una proteína fluorescente adecuada; Science, 2009, 324: 804 Resultados de la investigación del profesor Qian Yongjian: proteína fluorescente en el infrarrojo cercano, que es muy adecuada para imágenes de fluorescencia in vivo).
2. Selección de CCD para obtención de imágenes de fluorescencia in vivo.
Seleccionar una lente CCD adecuada es muy importante para obtener imágenes con luz visible in vivo. ¿Cómo elegir el CCD con la fluorescencia in vivo más rentable? El CCD tiene algunos parámetros importantes:
1) Píxeles del CCD. Los píxeles del CCD determinan la calidad de la imagen. Cuanto mayores sean los píxeles, mejor será la calidad de la imagen. Debido a la fuerte luz de fondo fluorescente y a la evidente interferencia de la luz parásita no específica, se requiere una cámara CCD de alta resolución.
2) Iluminación frontal o iluminación trasera CCD. En términos generales, los CCD retroiluminados tienen una mayor eficiencia cuántica, pero solo tienen ventajas obvias en la detección de señales de luz extremadamente débiles (como imágenes de bioluminiscencia en organismos vivos), pero no son esencialmente los mismos que los CCD con iluminación frontal en términos de fuerte Detección de luz. La diferencia es que es más fácil saturar la luz y el costo es mayor. No es un componente convencional para la detección de fluorescencia.
3) Temperatura del CCD. Hay dos tipos de CCD de refrigeración: CCD de refrigeración de baja temperatura constante y CCD de refrigeración de temperatura relativamente baja. El fondo del CCD de refrigeración a baja temperatura constante es estable y se puede restar; sin embargo, debido al fondo inestable del CCD de refrigeración a temperatura relativamente baja, generalmente no se puede realizar una sustracción de fondo efectiva; Cuanto menor sea la temperatura de enfriamiento del CCD, menor será la corriente oscura.
Como se muestra en la Figura 3, cuando la temperatura de enfriamiento alcanza los -29 °C, la corriente oscura será tan baja como 0,03e/píxel/s, ya que el ruido generado por el propio instrumento se compone principalmente de ruido térmico de corriente oscura y lectura del CCD. ruido, actualmente sólo el ruido de lectura del CCD se reduce a 2erms. Por lo tanto, un CCD de temperatura más baja no puede reducir significativamente el ruido de fondo, pero aumenta considerablemente el costo.
4) Ruido de lectura del CCD y corriente oscura. El ruido de lectura del CCD y el ruido térmico de la corriente oscura son los principales factores que causan el ruido de fondo en los sistemas de imágenes, pero en las imágenes de fluorescencia, el ruido de fondo más importante proviene de la luz de fondo de la fluorescencia. La mejora de la relación señal-ruido de las imágenes de fluorescencia se basa principalmente en el control efectivo de la luz de fondo de fluorescencia y la tecnología de sustracción de fondo (Figura 4).
3. Interferencia de autofluorescencia
En las imágenes de fluorescencia in vivo, la autofluorescencia animal siempre ha preocupado a los investigadores. Antes de la aparición de los sistemas de imágenes in vivo con análisis multiespectral de la luz de excitación, los científicos se vieron obligados a tomar diversas medidas para reducir la autofluorescencia de los animales, como alimentar a los ratones con alimentos sin fluoresceína, utilizar ratones desnudos, etc. Los sistemas de imágenes in vivo ahora capaces de realizar análisis multiespectrales de la luz de excitación pueden separar fácilmente las señales de fluorescencia. Como se muestra en la Figura 5, la autofluorescencia de los alimentos, la vejiga, el cabello y la piel se puede distinguir y eliminar de manera efectiva. El análisis multiespectral de luz de excitación también se puede utilizar para detectar múltiples marcadores fluorescentes, lo que puede lograr múltiples marcadores para un ratón, reducir los costos experimentales y mejorar efectivamente la comparabilidad de los datos.
4. Posicionamiento preciso de las señales fluorescentes
Como se muestra en la Figura 6, si la señal coincide con el objetivo 100, esto es lo que persiguen los científicos, pero si la señal no lo hace; Si el posicionamiento es correcto, será una pesadilla científica. ¡Quizás una señal engañosa sea peor que ninguna señal!
El sistema multifuncional de imágenes corporales, que tiene imágenes estructurales (como rayos X, resonancia magnética) e imágenes funcionales (como fluorescencia, luminiscencia e isótopos), lo ayudará a salir de problemas y con precisión. localizar señales de fluorescencia. Como se muestra en la Figura 7, al realizar imágenes de rayos X en ratones, se puede obtener claramente la forma y posición del tracto gastrointestinal. Al superponer la señal de fluorescencia con los rayos X, la fluorescencia se superpone con el tracto gastrointestinal, de modo que la fluorescencia se superpone con el tracto gastrointestinal. La ubicación de la fluorescencia en el estómago se puede determinar con precisión en el intestino.