Cómo promover el movimiento de los neutrófilos en la médula ósea del ratón hacia la periferia

Equipo experimental: instrumentos (2 pequeñas tijeras rectas para oftalmología, 3 pequeñas pinzas curvas), goteros de plástico estériles, tubos de centrífuga de 15 ml, tubos EP de 4 ml, plato de cultivo, jeringa de 1 ml, 70 um malla de nailon, reactivo de centrifugación a baja temperatura: HBSS (1×, 10×). Solución madre de Percoll (percoll: 10×PBS=9:1), solución de percoll (45, 81, 62, 55, 50, diluidas respectivamente a la concentración correspondiente con 1×PBS).

Materiales: ratones C57 de 8-12 semanas de edad Procedimientos experimentales:

1. Matar a los ratones tirando de sus cuellos y separando sus tibias y fémures. Limpiar la tibia y el fémur con una gasa y remojarlos en alcohol al 75% durante 5 minutos.

2. Utilice una pequeña cizalla recta para cortar ambos extremos de la médula ósea para exponer la cavidad medular y enjuague con MNB, 1 ml cada vez, dos veces para la tibia y tres veces para el fémur.

3. Filtrar la solución de lavado con una malla de nailon de 70um y recoger las células mediante centrifugación a 600g±4°C durante 65438±00 minutos y reducir la velocidad a baja velocidad. 4. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 3 ml de solución 45 Percoll.

5. Preparación de gradiente de Percoll: 81 3 ml, 62 2 ml, 55 2 ml, 50 solución de Percoll 6 ml. Coloque con cuidado la suspensión celular en el gradiente de Percoll y centrifugue a 1600 g durante 30 minutos a 10 ° C sin frenar. 7. Deseche la solución por encima de la capa de 62 percoll y recoja la capa de percoll entre 62 y 81.

8. Lavar dos veces con 10 ml de MNB, 600 g, 10 ℃, 10 min, centrifugar. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 3 ml de MNB.

9. Colocar con cuidado la suspensión celular en 3ml de Histopaque 119, 1600g, 10°C durante 30 minutos, y centrifugar sin frenar para eliminar la capa de glóbulos rojos.

10. Recoger la capa de células entre 1119 y MNB, lavar dos veces con 10ml de MNB, 600 g, 10 min a 4°C y centrifugar a baja velocidad durante 11. Células de cultivo según sea necesario.