Cómo preparar anticuerpos monoclonales utilizando tecnología de hibridoma
2013-04-27 11:29
1. Inmunización animal
(1) Preparación del antígeno
Aunque los anticuerpos monoclonales La pureza del antígeno inmunitario no es muy alta, pero los antígenos de alta pureza aumentan las posibilidades de obtener los anticuerpos monoclonales necesarios y reducen la carga de trabajo del cribado. Por tanto, cuanto más puro sea el antígeno inmunitario, mejor, y debe determinarse según el antígeno que se esté estudiando y las condiciones del laboratorio. En términos generales, la fuente del antígeno es limitada, o sus propiedades son inestables y fáciles de cambiar durante la purificación, o es altamente inmunogénico, o los anticuerpos monoclonales necesarios se utilizan para la purificación o análisis de diferentes componentes del antígeno. Los antígenos utilizados para la inmunización sólo requieren una purificación preliminar, o incluso ninguna purificación, pero hay muchas impurezas en el antígeno, especialmente si estas impurezas son altamente inmunogénicas, el antígeno debe purificarse. El antígeno utilizado para la detección puede tener la misma pureza que el antígeno inmunizante o una pureza diferente, dependiendo principalmente del tipo de método de detección utilizado y de su especificidad y sensibilidad.
(2) Selección de animales inmunizados
Según las células de mieloma utilizadas se pueden seleccionar ratones y ratas como animales inmunizados. Debido a que todas las líneas celulares de mieloma de ratón utilizadas en la tecnología de hibridomas se derivan de ratones BALB/c y todas las células de mieloma de rata se derivan de ratas LOU/c, estos dos animales puros se utilizan en la producción de hibridomas inmunes de rutina. Pero a veces se necesitan cruces interespecíficos con fines especiales para poder inmunizar a otros animales. La capacidad de los hibridomas interespecíficos para secretar anticuerpos es generalmente inestable porque los cromosomas se pierden fácilmente. En lo que respecta a los ratones, la primera inmunización es adecuada para las edades de 8 a 12 semanas, y las hembras son más cómodas de operar.
(3) Determinación del programa de inmunización
La inmunización es uno de los pasos importantes en la preparación de anticuerpos monoclonales. Su finalidad es hacer que los linfocitos B se diferencien y proliferen bajo la estimulación de antígenos específicos para facilitar la fusión celular para formar células híbridas y aumentar las posibilidades de obtener hibridomas que secreten anticuerpos específicos. Por lo tanto, al diseñar un programa de inmunización, se tienen en cuenta la naturaleza y pureza del antígeno, la dosis del antígeno, la vía de inmunización, el número e intervalos de inmunización, la aplicación de adyuvantes y la capacidad del animal para responder al antígeno. debe ser considerado. Ningún calendario de vacunación es adecuado para todos los tipos de antígenos. La mayoría de los procedimientos de inmunización actuales implican métodos para preparar anticuerpos policlonales convencionales. La tabla 6-1 enumera los programas de vacunación comúnmente utilizados actualmente. Vía de inmunización Los métodos de inmunización in vivo comúnmente utilizados incluyen inyección subcutánea, inyección intraperitoneal o inyección intravenosa, y también pueden ser gotas plantares, intradérmicas, nasales o para los ojos. La inmunización de refuerzo final se administra por vía intraperitoneal o intravenosa. Actualmente, este último es el más favorecido porque permite que el antígeno actúe sobre las células del bazo de forma más rápida y completa. Lo mejor es recolectar el bazo para la fusión el tercer día después de la última inmunización de refuerzo. Los resultados de muchos laboratorios han demostrado que durante las respuestas inmunes primaria y secundaria, los esplenocitos se fusionan con las células de mieloma, con picos de formación de hibridomas específicos en los días 4 y 22, respectivamente. Los hibridomas obtenidos en la reacción inmune primaria secretan principalmente anticuerpos IgM, mientras que los hibridomas obtenidos en la reacción inmune secundaria secretan principalmente anticuerpos IgG. El autor se dio cuenta de que no existe una relación paralela obvia entre el pico de hibridoma positivo y el título de anticuerpos séricos del ratón, y la mayoría de ellos preceden al pico de anticuerpos séricos. Por lo tanto, para lograr la mayor tasa de formación de hibridomas, es necesario tener tantos blastos plasmáticos como sea posible y es más apropiado tomar el bazo para fusionarlo el tercer día después de la última inmunización de refuerzo. Se ha informado que la inmunización esplénica puede mejorar la reactividad inmune de los ratones a los antígenos y ahorrar tiempo. Generalmente, los ratones pueden fusionarse después de 3 días de inmunización.
2. Fusión celular
(1) Preparación del reactivo principal
A. Medio de cultivo celular El medio de cultivo celular utilizado en la tecnología de hibridoma incluye principalmente RPMI-1640. o DMEM (medio de águila modificado por Dulberco). El método de preparación específico se llevó a cabo según los procedimientos especificados por el fabricante. Después de la preparación, filtrar y esterilizar (0,22 um), tomar alícuotas y almacenar a 4°C.
Medio RPMI-1640 incompleto: 96 ml de solución madre de medio RPMI-1640.
Solución 100×1.G 1 ml
Solución doble anticuerpo 1 ml
Solución de bicarbonato sódico 7,5 1-2 ml
HEPES Solución 1 ml
Medio DMEM incompleto: DMEM 13,37g g
Agua ultrapura o agua tetradestilada 980ml.
Bicarbonato de sodio 3,7 gramos
Solución doble anticuerpo 10 ml
Solución 100×1.G 10 ml
Ajustar PH con clorhídrico 1N ácido a 7,2-7,4, esterilizar por filtración y almacenar a 4°C.
Medio RPMI-1640 o DMEM completo: 80 ml de medio RPMI-1640 o DMEM incompleto.
15-20 ml de suero de ternera
Se utiliza para el cultivo de células de mieloma SP2/0 y células de hibridoma tras su establecimiento.
HT M: Completo RPMI-1640 o DMEM M 99 ml.
Solución de conservación alta temperatura 1 ml
Cap M: Completo RPMI-1640 o DMEM M 98ml.
Solución de almacenamiento a alta temperatura 1 ml
Solución de almacenamiento 1 ml
b. Solución de almacenamiento de aminopterina (A) (100×, 4×10-5mol/ L). ): Pesar 1,76 mg de aminopterina MW 440,4, disolverlo en 90 ml de agua ultrapura o agua tetradestilada y añadir 65438 gota a gota. Esterilizar por filtración, dividir en alícuotas en viales (2 ml/frasco) y almacenar a -20 °C.
Solución de almacenamiento de hipoxantina y timidina (HT) (100×, H: 10-2mol/L, T: 1,6× 10-3 mol/L): pesa 136,5035888666 MW 136,1) y 38,8 mg de timidina, MW 242.2), añadir agua ultrapura y calentar a 37°C antes de usar para ayudar a disolver.
d. Solución de L-glutamina (L.G.) (100×, 0,2 mol/L): Pesar 2,92 g de L-glutamina (PM 146,15) y utilizar 100 ml.
E. Solución de penicilina y estreptomicina (doble anticuerpo) (100 veces): Tomar 10.000 unidades de penicilina G (sal sódica) y 1 gramo de estreptomicina (sulfato), y disolverlos en 100 ml de desinfectante. Bacterias agua ultrapura o cuatro partes de agua destilada, dividida en frascos pequeños (4-5 ml/botella).
f. solución 7,5 NaHCO3: Pesar 7,5 g de nah co 3 grado analítico, disolver en 100 ml de agua ultrapura o agua tetradestilada, filtrar y esterilizar, poner en frascos pequeños (4-5 ml/botella), tapar tapar el frasco y conservar a 4°C.
g, solución de HEPES (1 mol/L): Pesar 23,83 g de hepes (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-n,-2-etanosulfónico, N-2-hidroxietilpiperazina-N,-2-etanosulfónico ácido, peso molecular 238,3), disuelto en 65438.
h, solución de almacenamiento de 8-azaguanina (100×): Pesar 200 mg de 8-azaguanina (PM 152,1), añadir 1 ml de NaOH 4 mol/L y esperar hasta que se disuelva. Añadir agua ultrapura o destilada. agua99. Distribuir alícuotas en viales y congelar a -20°C. Cuando se utilice, agréguelo al medio de cultivo a una concentración de 1 (es decir, la concentración final es 20 ug/ml).
1. 50 PEG: Pesar 1.000 o 4.000 20-50 g de PEG en un matraz Erlenmeyer, cerrar bien la tapa, fundir al baño maría a 60-80°C y distribuir 0,6 ml en Una botella de penicilina, cierre bien la tapa, cocine al vapor 8 libras de vapor a alta presión durante 15 minutos y guárdelo a -20°C para su uso posterior. Caliente para descongelar antes de usar, agregue una cantidad igual de medio de cultivo incompleto, ajuste el pH a 8,0 con un poco de NaHCO3 7,5 o compre productos ya preparados de Sigma o Gibco.
⑵Preparación de las células de mieloma
El método de mantenimiento de las células de mieloma antes de la fusión es el más importante para la obtención exitosa de hibridomas.
El objetivo es mantener las células creciendo logarítmicamente durante el mayor tiempo posible, y esto debe ser al menos 1 semana antes de la confluencia. Se necesitan dos semanas para que las células congeladas alcancen un estado adecuado para la fusión después de la reanimación, y las células de mieloma necesitan al menos varios días para recuperarse. El crecimiento logarítmico de las células de mieloma en el laboratorio se mantuvo en un medio que contenía un 10% de suero bovino fetal. El método consiste en inocular células de mieloma diluidas en serie diez veces en seis frascos de cultivo que contienen 5 ml de medio de cultivo. Una semana después, se volvió a trasplantar una botella con células bastante densas y sin crecimiento. El tiempo típico de duplicación es de 14 a 16 horas.
El método de preparación de la suspensión de células de mieloma es el siguiente:
a. 48-36 horas antes de la fusión, expandir y cultivar las células de la médula ósea (generalmente según la prueba de fusión en placa de 96 pocillos). , botella de cultivo de 100 ml. Las células cultivadas en el medio requieren entre 2 y 3 botellas para prepararse).
B. El día de la fusión, utilice un gotero para abrir suavemente las células tumorales en la pared del frasco y recójalas en un tubo de centrífuga o tubo de fusión de 50 ml.
c. Centrifugar a 1000 rpm durante 5-10 minutos y desechar el sobrenadante.
d. Añadir 30 ml de medio de cultivo incompleto, centrifugar y lavar una vez. Luego se resuspendieron las células en 10 ml de medio incompleto y se mezclaron completamente.
e. Tome la suspensión de células de mieloma y agregue una solución de tinte azul tripán 0,4 para contar las células viables y reservar. Al contar las células, agregue 0,1 ml de suspensión celular a 0,9 ml de colorante azul tripán, mezcle bien y cuente con un hemocitómetro. La fórmula para calcular el número de celdas es: número de celdas por mililitro = número de celdas en cuatro cuadrados grandes × 105/4 o número de celdas por mililitro = número de celdas en cinco cuadrados × 106/2;
⑶Preparación de linfocitos del bazo
Tomar los ratones BALB/c inmunizados, retirar los globos oculares, recoger sangre y separar el suero como suero de control positivo para la detección de anticuerpos. Al mismo tiempo, los ratones fueron sacrificados mediante dislocación cervical, sumergidos en alcohol al 75% durante 5 minutos, fijados en la mesa de disección y luego destaparon la piel del abdomen izquierdo para revelar el bazo y lo reemplazaron con tijeras oftálmicas. Cortar el peritoneo con tijeras quirúrgicas estériles en una mesa limpia, retirar el bazo, colocarlo en una placa de Petri que contenga 65.438 00 ml de medio de cultivo incompleto, lavar suavemente y retirar con cuidado el tejido conectivo circundante. Mueva el bazo a otra placa de cultivo que contenga 10 ml de medio de cultivo incompleto. Utilice unas pinzas en forma de codo o una aguja curva unida a una jeringa de 1 ml para apretar suavemente el bazo (o apretar el bazo con el núcleo de una jeringa) para permitir la células del bazo para ingresar en medio de cultivo incompleto en una placa de Petri. Sople varias veces con una pipeta para hacer una suspensión de células individuales. Para eliminar trozos grandes de la suspensión de células del bazo, filtre a través de una malla de cobre de 200 mallas. Cosechar la suspensión de células del bazo, centrifugar a 1000 r/min durante 5 a 10 minutos, centrifugar y lavar 1 a 2 veces con medio incompleto, luego resuspender las células en 10 ml de medio incompleto, mezclar bien, tomar la suspensión anterior y agregar fenol azul. El tinte se utiliza para contar células viables y se utiliza para su uso posterior. Normalmente, se pueden obtener 1 x 108-2,5 x 108 esplenocitos de cada ratón y 5 x 108-108 células de bazo de cada rata.
⑷Preparación de células alimentadoras
Durante el proceso de cultivo selectivo después de la fusión celular, debido a la muerte de una gran cantidad de células de mieloma y células del bazo, la mayoría de las células de hibridoma dispersas en este tiempo No es fácil sobrevivir y, por lo general, es necesario agregar otras células vivas para que prolifere. Este mayor número de células vivas se denominan células alimentadoras. Los mecanismos por los cuales las células alimentadoras promueven la proliferación de otras células siguen siendo desconocidos. En general, se cree que pueden liberar factores estimulantes del crecimiento no específicos de especie y proporcionar las condiciones de crecimiento necesarias para las células de hibridoma. También puede ser para satisfacer la dependencia de la densidad celular de las nuevas células de hibridoma.
Las células alimentadoras más utilizadas son los timocitos, los esplenocitos normales y los macrófagos peritoneales. Entre ellos, los macrófagos peritoneales de ratón son más convenientes de obtener y preparar y pueden fagocitar y eliminar células muertas y sus desechos, por lo que son los más utilizados. El método de preparación es el siguiente:
Después de matar, desinfectar y fijar a los ratones utilizando el método anterior para recolectar células del bazo, use tijeras esterilizadas para levantar la piel abdominal de la parte posterior del abdomen para exponer el peritoneo. Limpie el peritoneo con un hisopo con alcohol para desinfectarlo. Utilice una jeringa para inyectar 10 ml de medio de cultivo incompleto en la cavidad abdominal, teniendo cuidado de no penetrar en el intestino.
Fije la jeringa con la mano derecha y deje la aguja en la cavidad abdominal. Utilice la mano izquierda para masajear suavemente el abdomen con un algodón con alcohol durante 1 minuto y luego succione el líquido del cultivo inyectado. Centrifugar a 1000 rpm durante 5-10 minutos y desechar el sobrenadante. Primero, resuspender las células sedimentadas en 5 ml de medio HAT. Según los resultados del recuento de células, agregue medio HAT para que la concentración celular alcance 2 × 105 células/ml. Generalmente, para los macrófagos, se requieren 2 × 104 células/pocillo para placas de 96 pocillos y 105 células/pocillo para placas de 24 pocillos. Cada ratón puede obtener de 3 a 5 × 106 células, por lo que un ratón puede recibir dos placas de células de 96 pocillos. Las células alimentadoras también se pueden preparar y cultivar 1-2 días antes de la fusión celular, de modo que se extienda una capa de células alimentadoras en el fondo del pocillo de la placa de cultivo. El método consiste en agregar la suspensión celular anterior en una placa de 96 pocillos, 0,1 ml por pocillo (equivalente a 2 gotas) y luego colocarla en una incubadora a 37 °C que contenga 6 CO2 para cultivo.
5. Fusión celular y cultivo selectivo de células de hibridoma.
Hay muchos métodos de fusión celular reportados, y aquí está el que se usa comúnmente en el laboratorio del autor.
a. Mezcle 1×108 esplenocitos y 2×107-5×107 células de mieloma SP2/0-Ag14 en un tubo de fusión de 50 ml, agregue medio de cultivo incompleto a 30 ml y mezcle bien.
b. Centrifugar a 1000 r/min durante 5-10 minutos y absorber el sobrenadante lo más limpiamente posible.
c. Golpee suavemente el fondo del tubo de fusión con la palma para aflojar y precipitar uniformemente las células; precalentarlo en un baño de agua a 40 °C.
d. Agregue 65438±0 ml de 50 PEG (pH 8,0) precalentado a 40 °C durante aproximadamente 65438 ±0 minutos (el tiempo óptimo es 45 segundos) y revuelva suavemente mientras agrega.
e. Utilice una pipeta de 10 ml para agregar 20-30 ml de medio de cultivo incompleto precalentado a 37 °C en 90 segundos;
f, 1000 rpm durante 5 minutos; desechar el sobrenadante
g, agregar 5 ml de medio de cultivo HAT, aspirar suavemente las células precipitadas para suspenderlas y mezclarlas uniformemente, y luego agregar por vía intraperitoneal. macromoléculas que contienen Añadir el medio HAT para fagocitosis a 80-100 ml.
h. Dispensar en placas de cultivo celular de 96 pocillos, 0,10-0,15 ml por placa; alícuotas en placas de 24 pocillos, 1,0-1,5 ml por placa y luego colocar la placa de cultivo en cultivo a 37 °C; y 6 CO2 cultivados en la caja.
1. Después de 5 días, sustituir la mitad del medio por medio HAT.
j, después de 7-10 días, reemplace el medio HT con medio HAT (el medio completo normal se puede usar después de 14 días);
l.Observar el crecimiento de las células del hibridoma con frecuencia. Cuando crezcan hasta 1/10 del área de la base, aspirar el sobrenadante para la detección de anticuerpos.
3. Detección de células de hibridoma
Las células de hibridoma se pueden seleccionar aproximadamente 2 semanas después de la fusión, es decir, los pocillos de hibridoma que secretan los anticuerpos necesarios se seleccionan a menudo entre muchos pocillos. llamada prueba de anticuerpos. Existen muchos métodos para detectar anticuerpos, que a menudo dependen del antígeno que se estudia y de las condiciones del laboratorio. Sin embargo, como método de detección de anticuerpos para la detección de hibridomas, debe ser rápido, rápido, simple y conveniente procesar una gran cantidad de muestras a la vez. Porque para decidir sobre la selección de células de hibridoma, a menudo se necesitan cientos de muestras y los resultados deben comunicarse en tan solo unas horas. Por lo tanto, los principios para seleccionar métodos de detección de anticuerpos son rápidos, sensibles, específicos, confiables, de bajo costo y que ahorran mano de obra. En general, es necesario establecer métodos de detección de anticuerpos antes de la fusión para superar posibles problemas. Otra cuestión importante es el "rango dinámico" requerido de un método de detección de anticuerpos, es decir, la relación entre la señal más fuerte por encima del fondo y la señal más débil, que depende de si el antígeno de detección utilizado es puro. Si el anticuerpo del hibridoma está dirigido contra un antígeno proteico purificado y en la reacción participan 100 antígenos, será suficiente un sistema de discriminación positivo/negativo. Por otro lado, si los anticuerpos del hibridoma están dirigidos contra un pequeño número de antígenos proteicos en la superficie celular, es posible que el sistema de detección necesite ser capaz de detectar señales débiles, y el rango cinético debe ser al menos 10:1, preferiblemente 100. :1. Además, la elección del método de detección depende del tipo de anticuerpo de hibridoma requerido y del uso previsto.
Los anticuerpos que se unen al complemento pueden seleccionarse mediante ensayos basados en respuestas citotóxicas. Si se requieren anticuerpos de hibridoma que se unan a la proteína A, se debe utilizar un ensayo de unión a la proteína A.