Cómo diseñar modelos de ratones con genes knockout condicionales
El principio de Cre/LoxP o Flipe/Frt se utiliza en el diseño de ratones con genes knockout condicionales. Ambos son sistemas de recombinasa específicos de sitio. Tomemos como ejemplo el sistema Cre/LoxP. Por ejemplo, las secuencias loxP se colocan en ambos extremos de la secuencia de ADN objetivo que se va a eliminar, lo que da como resultado ratones flox (flanqueados por loxP). Los ratones Flox se aparean con ratones que expresan específicamente Cre en células para obtener ratones en los que el gen diana está inactivado en células específicas, es decir, ratones inactivados condicionalmente. Además, si se combina con otros sistemas inducibles que controlan la expresión de Cre (como CreERT2), un gen también puede regularse temporal y espacialmente.
El sistema Cre/loxP se deriva de fagos y puede mediar en la recombinación de ADN específica de un sitio. El sistema consta de dos partes: una parte es una secuencia de ADN de 34 pb (secuencia LoxP), que contiene dos repeticiones invertidas de 13 pb y una secuencia central de 8 pb. La dirección de LoxP está determinada por las ocho bases en el medio. Esta secuencia LoxP es el sitio reconocido por la recombinasa Cre. Uno de los componentes es la recombinasa Cre. Es una proteína de 343 aminoácidos codificada por un bacteriófago. Cre puede mediar en la recombinación de dos sitios LoxP, lo que resulta en la eliminación de la secuencia de ADN entre los dos sitios LoxP. Si el ADNc de la recombinasa Cre se coloca debajo de un promotor específico de tejido o célula mediante ingeniería genética, se pueden obtener ratones Cre con expresión específica de tejido/célula Cre, también conocidos como ratones herramienta Cre. Se pueden obtener ratones knockout condicionales apareando con ratones Flox.
El llamado ratón Flox hace referencia a colocar una secuencia LoxP a ambos lados del exón de un gen. Esta secuencia está flanqueada por LoxP, también conocido como ratón Flox. Este tipo de ratón Flox se obtiene generalmente diseñando y construyendo vectores dirigidos, recombinando células madre embrionarias, microinyectando blastocistos y pasando ratones quiméricos. Este tipo de ratones se aparea con ratones herramienta Cre. Debido a la expresión de Cre, está mediada la recombinación de las dos secuencias del sitio LoxP, eliminando así la secuencia entre los dos sitios LoxP. Dado que la expresión de Cre de diferentes ratones herramienta Cre es específica de tejido/célula, el gen diana puede desactivarse específicamente en diferentes tejidos y células. Como células epiteliales, timocitos, células T, células B, cardiomiocitos, intestinos, pulmones, etc.
Entonces, ¿cómo diseñar ratones knockout condicionales? El diseño mencionado aquí es principalmente el del ratón Flox. La eliminación condicional significa que no hay expresión genética anormal en otras células, excepto en células específicas. En general, no coloque secuencias LoxP antes del primer exón. Porque el primer exón suele ir precedido de un promotor. La colocación de secuencias LoxP puede interrumpir o alterar la actividad del promotor. La eliminación condicional es generalmente el primer exón que se elimina y provoca una mutación por cambio de marco. En este caso, es mejor no eliminar el exón con ATG como codón de inicio. De lo contrario, el gen puede utilizar el ATG en el ORF para codificar una proteína que carece de parte de la secuencia N-terminal, que puede tener todas o parte de las funciones de la proteína de tipo salvaje. Al seleccionar el exón que se va a eliminar (colocando un LoxP en ambos lados de un exón), el número de bases en el exón no puede ser 3N; de lo contrario, el ARNm obtenido al empalmar el pre-ARN del nuevo gen no puede producir mutaciones por desplazamiento de marco. Producirá una nueva proteína que carece de una secuencia intermedia en comparación con la proteína salvaje. Si el número de bases en un exón es 3N+1 o 3N+2, se producirá una mutación por desplazamiento de marco después de que se elimine el exón, y se podrá lograr el propósito de la eliminación del gen. Cuando se seleccionan exones que se van a fijar, generalmente es necesario seleccionar exones adecuados de los exones más aguas arriba. Cabe señalar que el software general de análisis de ADN no puede determinar los límites entre intrones y exones y debe comprobarse cuidadosamente. Más del 95% de los límites siguen el principio de límites gt/ag. También puedes buscar exones e intrones de un gen en Ensembl. La mayoría de los resultados de este sitio son correctos. Pero también requiere una inspección cuidadosa. Después de todo, el desarrollo de ratones knockout es un proceso largo que requiere cuidados especiales. No pienses demasiado en la etapa inicial. Estos principios son consideraciones generales únicamente. Situaciones especiales requieren un tratamiento especial.