En términos de habilidades experimentales
Así que la llamada máquina PCR es en realidad un sistema automático de control de temperatura.
Podemos ver que después de la duplicación aquí, una hebra en realidad se sintetiza recientemente y la otra hebra es preexistente, por lo que se llama duplicación semiconservativa.
1. Plantilla (1 ng/μL)
La plantilla de ADN se puede obtener de varios tejidos biológicos y la concentración suele ser de 1 ng/μ L. Cuanto mayor sea la concentración, mayor mejor. . Las concentraciones demasiado altas pueden dar como resultado una unión no específica sustancial.
2. Imprimación (10 μmol/L)
La concentración de imprimación suele ser de 10 μmol/L
La concentración de imprimación es demasiado baja y el rendimiento es baja;
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La concentración del cebador es demasiado alta, lo que produce desajustes, inespecificidad y dímeros del cebador.
3. Enzima Taq (5 unidades/microl)
u es la unidad de actividad enzimática, que se define como la capacidad de convertir 1 μ mol de sustrato o conversión en 1 minuto. a 25°C Contenido de enzima del grupo relevante en 1 μmol de sustrato (otras condiciones son las más adecuadas).
4. Dinitrotolueno (2,5 mmol/L)
El DNTP puede combinarse con Mg2+ y reducir la concentración de Mg2+ libre, afectando así a la actividad de la ADN polimerasa.
5. Tampón (incluido Mg2+)
Mg2+ es un activador de la ADN polimerasa.
Bajas concentraciones de Mg2+ reducirán la actividad de la ADN polimerasa y el rendimiento de la PCR.
Si la concentración de Mg2+ es demasiado alta, la especificidad se reducirá.
Detectar el producto de la reacción mediante electroforesis en gel de agarosa.
QPCR en tiempo real se refiere a agregar un grupo fluorescente a la reacción de PCR y monitorear continuamente la secuencia y los cambios de intensidad de la señal fluorescente para analizar la cantidad inicial del gen objetivo en tiempo real. La invención de esta tecnología supuso un salto de la PCR cualitativa a la cuantitativa.
Almacenados en tubos EP importados de 300u cada uno.
Agita bien la solución de almacenamiento antes de envasar.
Preparar sistemas fluA y fluB respectivamente.
El citómetro de flujo, las células de muestra y los tintes fluorescentes son los tres elementos principales del citómetro de flujo.
El objeto de detección de la citometría de flujo son células suspendidas en un líquido en un estado independiente, y no puede detectar células directamente en bloques de tejido. Los órganos o tejidos deben prepararse en suspensiones unicelulares mediante diversos métodos y luego marcarse con anticuerpos conjugados con fluoresceína antes de que puedan detectarse mediante citometría de flujo.
La citometría de flujo es ampliamente utilizada, especialmente en los campos de la inmunología y la medicina clínica [3-6]. Ahora la citometría de flujo también puede ayudar en el diagnóstico y clasificación de muchas enfermedades, especialmente la leucemia.
El citómetro de flujo es un dispositivo que analiza y clasifica las células de forma automática. Puede medir, almacenar y mostrar rápidamente una serie de importantes parámetros característicos biofísicos y bioquímicos de células dispersas suspendidas en líquido, y puede clasificar subpoblaciones de células designadas en función de rangos de parámetros preseleccionados.
Aunque los distintos modelos de citómetros de flujo varían mucho, sus estructuras básicas son las mismas y generalmente se dividen en: sistema de flujo de líquido, sistema óptico, sistema de detección y sistema de clasificación [7]. El citómetro de flujo analítico se compone principalmente de los primeros tres sistemas, y el citómetro de flujo de clasificación tiene un sistema de clasificación más que el citómetro de flujo analítico.
El sistema de flujo de fluidos consta de dos grupos de flujos de fluidos estrechamente relacionados pero independientes, a saber, el flujo de fluido envolvente y el flujo de muestra. El flujo de líquido envolvente comienza desde el cilindro de líquido envolvente, ingresa a la boquilla a través de la tubería y forma un flujo de líquido estable y visible a través del pequeño orificio en la boquilla. La característica básica del líquido de la vaina es la isotonicidad, lo que garantiza que las células del líquido de la vaina no morirán debido a la hipotonicidad o la hipertonicidad. Una corriente de muestra es una corriente líquida que contiene celdas de muestra para el análisis de muestras. El flujo de muestra comienza desde el tubo de muestra, ingresa a la boquilla a través de una tubería especial y luego el líquido envolvente sale de la boquilla para formar un flujo de líquido visible y finalmente fluye hacia el cubo de líquido residual a través del orificio para líquido residual. Al cargar muestras para análisis, aunque los dos líquidos están en contacto entre sí, no se mezclan entre sí, sino que forman un flujo laminar, con el flujo de muestra en el medio y el flujo de envoltura en la periferia, con diferentes. presiones que actúan sobre ellos. El operador puede controlar la tasa de muestreo ajustando la diferencia entre la presión positiva de la muestra y la presión positiva del fluido de la funda. Cuanto mayor sea la diferencia entre la presión positiva de la muestra y la presión positiva del fluido envolvente, mayor será el diámetro del flujo de muestra en el flujo de líquido. El análisis de muestras es más rápido.
El sistema óptico comienza con el láser, que es uno de los componentes necesarios del citómetro de flujo.
Las señales ópticas generadas por láseres emitidos por diferentes células que irradian láseres serán recibidas por diferentes canales a través de diferentes sistemas de trayectoria óptica. El citómetro de flujo necesita recibirlas a través de diferentes canales receptores a través de un sistema óptico, y luego reflejar indirectamente las propiedades físicas y químicas de las células a través de la intensidad de las señales.
El sistema de camino óptico consta de una serie de lentes, filtros y diafragmas, que separan diversas señales ópticas según diferentes longitudes de onda, entre las que destacan los filtros. Según sus diferentes funciones, se puede dividir en tres tipos: filtro de paso largo, filtro de paso corto y filtro de paso de banda. La función de un filtro de paso largo es que la luz con una longitud de onda mayor que una longitud de onda específica pueda pasar a través de él y la luz con una longitud de onda menor que esa longitud de onda se refleje. La luz con longitudes de onda más pequeñas que una longitud de onda específica puede pasar a través de un filtro de paso corto, mientras que la luz con longitudes de onda mayores que esa longitud de onda se refleja. La función de un filtro de paso de banda es permitir el paso de la luz de una determinada longitud de onda, mientras que la luz con longitudes de onda fuera de este rango se refleja.
Utilice diferentes tipos de filtros ópticos para dividir la señal óptica mezclada en 6 señales ópticas diferentes, que ingresan a 6 canales diferentes respectivamente, a saber, canal SSC, canal FIFC, canal PE, canal PE-TxRed, PE-Cy5. canal y canal PE-Cy7.
El sistema de detección y análisis del citómetro de flujo resume y analiza las señales luminosas de cada canal de las células por canal, y finalmente obtiene las propiedades físicas y químicas de las células de la población de muestra. Cabe mencionar aquí el concepto de tubo fotomultiplicador. Las señales ópticas separadas por el filtro óptico según diferentes longitudes de onda ingresan finalmente a sus respectivos canales, es decir, a sus respectivos tubos fotomultiplicadores. La función principal del tubo fotomultiplicador es convertir señales ópticas en señales eléctricas y al mismo tiempo amplificar las señales en una determinada proporción.
Según las diferentes propiedades de la señal luminosa, los canales del citómetro de flujo se pueden dividir en canales de luz dispersa y canales de fluorescencia. El canal de luz dispersada es un canal que recibe luz dispersada, a saber, el canal de luz dispersada hacia adelante (FSC) y el canal de luz dispersada lateral (SSC). El método de denominación del canal de fluorescencia es qué fluoróforo recibe principalmente la fluorescencia del canal, por lo que se denomina según el nombre del fluoróforo. Por ejemplo, el canal FITC recibe señales de fluorescencia excitadas por un láser de 488 nm con una longitud de onda de 510-550 nm. Por tanto, cuando las células se unen a anticuerpos a través de Super FITC, la señal representada por este canal es la señal FITC. Cuanto más fuerte es la señal de fluorescencia recibida por el canal, más fluoresceína FITC se une a las células. Por conveniencia, este canal se denomina canal FITC. Además, el canal que lleva el nombre de la fluoresceína principal no solo puede recibir la señal de fluorescencia excitada por la fluoresceína, sino que también puede recibir y analizar las señales de fluorescencia excitadas por otras fluoresceínas, como el canal FITC, y también puede recibir las señales de fluorescencia de GFP. y CFSE excitado por el láser de 488 nm.
Las señales de luz dispersa y las señales de fluorescencia se convierten en señales eléctricas a través de tubos fotomultiplicadores, que son recibidos y analizados por el sistema informático en forma de pulsos electrónicos y ondas electrónicas. Hay tres formas principales de comparar el tamaño de las ondas de electrones, a saber, la longitud, el ancho y el área de la onda de electrones. Los tres parámetros pueden reflejar el tamaño de la señal óptica, pero el área del parámetro representa el tamaño de la onda electrónica con mayor precisión que la longitud y el ancho.
La citometría de flujo de clasificación tiene un sistema más que la citometría de flujo analítica, es decir, el sistema de clasificación de flujo. El citómetro de flujo de clasificación puede separar las células objetivo de las células de muestra. Una vez recuperadas las células de muestra, se pueden cultivar nuevamente, es decir, las células clasificadas están activas y estériles.
Detección de subpoblaciones de linfocitos y seguimiento del estado inmunológico celular (los linfocitos son un gran grupo de células que desempeñan funciones importantes en el sistema inmunológico humano. Durante el proceso de respuesta inmune, los linfocitos de sangre periférica se desarrollan y diferencian en subpoblaciones con diferentes funciones Cuando el número y la función de las subpoblaciones son anormales, puede provocar trastornos inmunológicos y cambios patológicos [10-11]. FCM puede detectar uno o varios antígenos de superficie de linfocitos al mismo tiempo para distinguir diferentes subpoblaciones de células de linfocitos. sus proporciones para monitorear el estado inmunológico del paciente y guiar el tratamiento midiendo el número de subpoblaciones de linfocitos).
Análisis del ciclo celular: En cada fase del ciclo celular (G0, G1, S, G2, M), el contenido de ADN cambia periódicamente con cada fase [12]. Marcando el ADN con colorantes de ácidos nucleicos y analizándolo con citometría de flujo, se puede obtener la distribución de células en cada período y calcular G0/G1%, S% y G2/M%. Comprender la distribución del ciclo celular y la actividad de proliferación celular. Ciclinas, Ki67, antígeno nuclear proliferativo (PCNA), etc.
También se puede utilizar para estadificar con precisión el ciclo celular: G0, G1, S, G2, m. Se puede utilizar para: diagnóstico temprano de tumores, evaluación de tumores benignos y malignos, observación del estado de proliferación celular, distribución del ciclo y eficacia. escucha.
Detección de marcadores específicos de células: FCM no sólo puede analizar marcadores de forma cualitativa, sino también cuantitativa. El número de grupos de antígenos por célula se puede calcular utilizando microesferas estándar marcadas con un número conocido de moléculas de fluoresceína como referencia.