Cómo detectar la apoptosis celular mediante citometría de flujo

La apoptosis, a menudo llamada muerte celular programada, es un proceso de muerte celular activa controlado por genes. Cada vez más datos han encontrado que la apoptosis está estrechamente relacionada con muchas enfermedades. Por ejemplo, las células cancerosas tienen la capacidad de continuar proliferando y resistiendo la apoptosis. El análisis de la apoptosis celular mediante citometría de flujo puede proporcionar importantes indicadores de referencia para el diagnóstico de tumores, la evaluación de la eficacia y la predicción del pronóstico. Sin embargo, muchos estudiantes experimentales a menudo se encuentran con el fenómeno de demasiada muerte celular pero no se detecta apoptosis, y los resultados repetidos son inconsistentes. ¡Este artículo analizará cómo hacer que los datos de apoptosis celular sean más hermosos y precisos!

En primer lugar, aclarar la diferencia entre apoptosis y necrosis.

La apoptosis es un evento de muerte celular activa que implica la activación, expresión y regulación de una serie de genes. Es el proceso de muerte en el que las células se esfuerzan activamente por adaptarse mejor al medio ambiente. Las manifestaciones específicas son: gemación para formar cuerpos apoptóticos, escisión del ADN entre nucleosomas, fagocitosis y digestión de cuerpos apoptóticos, etc. [1] (como se muestra en la figura siguiente).

Figura 1: El proceso de apoptosis [1]

La necrosis es un proceso pasivo en el que las células se ven afectadas por fuertes factores físicos, químicos o biológicos, lo que resulta en cambios desordenados en las células. El proceso de muerte es el fenómeno de la autolesión en condiciones patológicas. Las manifestaciones específicas son: hinchazón celular, rotura de la membrana celular, desbordamiento del contenido celular, cambios nucleares lentos y degradación insuficiente del ADN, que pueden provocar reacciones inflamatorias locales graves (como se muestra en la figura siguiente).

Figura 2: El proceso de necrosis celular [1]

1. Principio de detección de apoptosis por citometría de flujo

El método de doble tinción con anexina V y PI es un flujo. método de citometría. El método clásico para detectar la apoptosis se basa en el hecho de que la fosfatidilserina (PS) de la membrana celular voltea desde el interior de la membrana celular hacia la superficie de la membrana celular en las primeras etapas de la apoptosis (Figura 3 a continuación).

Figura 3: PS surge de la membrana celular en la etapa temprana de la apoptosis.

Este método permite distinguir células vivas, células apoptóticas y células necróticas de forma sencilla, rápida y precisa. El principio específico es el siguiente:

Por tanto, cuando la anexina V se une al PI, se puede utilizar para identificar células vivas, células apoptóticas y células muertas.

II.Pasos experimentales

Tercero, análisis de datos

El kit de detección de apoptosis con anexina V-FITC/PI utiliza la proteína V anexina marcada con FITC como sonda. . La longitud de onda de excitación máxima de FITC es 488 nm y la longitud de onda de emisión máxima es 525 nm. La fluorescencia verde de FITC se detectó en el canal FL1. La longitud de onda máxima de excitación del complejo PI-DNA es de 535 nm y la longitud de onda máxima de emisión es de 615 nm. La fluorescencia roja de PI se detecta en el canal FL2 o FL3. Mediante análisis de software, se dibuja un diagrama de dispersión de dos colores con FITC como abscisa y pi como ordenada.

Como se muestra en la siguiente figura; las celdas se pueden dividir en cuatro cuadrantes;

Figura 4: Diagrama de distribución de celdas en cuatro cuadrantes.

Por ejemplo, se suele utilizar para estudiar los efectos de fármacos o genes sobre la apoptosis. Al comparar el grupo de control con el grupo del fármaco, se descubrió que el compuesto podía inducir la apoptosis en la línea celular de cáncer de próstata PC-3M. En comparación con el grupo de control (0 μM), la proporción de células apoptóticas tardías en el grupo de tratamiento (20 μM) aumentó del 1,79 % al 11,39 %. Además, el porcentaje de células viables, apoptóticas y necróticas se puede calcular en función de los datos de cada cuadrante.

Figura 5. Inducción de la apoptosis de las células PC-3M dependiente del gradiente de concentración del fármaco [2]

IV.Preguntas frecuentes

1.

2. ¿Por qué necesitamos recolectar sobrenadante celular?

Debido a que las células apoptóticas pueden desprenderse de la pared y quedar suspendidas en el medio de cultivo, es necesario recolectar el sobrenadante, recolectar el sedimento mediante centrifugación y combinar las células digeridas con tripsina; de lo contrario, la proporción apoptótica detectada puede reducirse.

3. ¿Por qué necesito ir a la computadora para realizar la prueba dentro de 1 hora después del teñido?

Debido a que la apoptosis es un proceso rápido, se recomienda analizar las muestras dentro de 1 hora después de la tinción. El PI se ve muy afectado por el tiempo, porque el etiquetado de PI aumentará la citotoxicidad, especialmente cuando se detecta la apoptosis temprana. Si se prolonga el tiempo, la diferencia en la agrupación de células en el citómetro de flujo aumentará significativamente. Se recomienda detectarla en 1 hora.

4. Otras medidas preventivas

Referencias:

[1]Elmore S. Apoptosis: Una revisión de la muerte celular programada.

Toxic Substances Pathol 200735:495-516.

[2] Qin Min, Peng Sheng, Liu Ning, et al. Un nuevo compuesto LG308 con actividad antimicrotúbulos en células de cáncer de próstata tiene una actividad antitumoral eficaz. .[J]. Revista de Farmacología y Terapéutica Experimental, 2015, 355(3): 473-483.