Detección de toxinas de microcistina

Existen muchos métodos para detectar microcistinas, como análisis biológico, pruebas de citotoxicidad, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), electroforesis capilar (CE), método de inhibición de la proteína fosfatasa, etc. Cada uno de estos métodos tiene sus propias ventajas, pero todos tienen distintos grados de deficiencias. Los métodos de detección biológica no pueden distinguir los isómeros de la microcistina y requieren una gran carga de trabajo. Los métodos de detección de citotoxinas tienen baja sensibilidad; el proceso de pretratamiento de la cromatografía líquida de alta resolución es complicado y el equipo es costoso. El método CE tiene poca reproducibilidad; el método de inhibición de la proteína fosfatasa no puede distinguir homólogos de toxinas específicos y el posprocesamiento es difícil. El método de prueba con animales es el método de análisis de toxicidad convencional más antiguo, que utiliza principalmente perfusión o inyección intraperitoneal para identificar la toxicidad de la microcistina en ratones. Este método puede reflejar intuitivamente la toxicidad general de la microcistina. Se prueba la microcistina extraída de microcistina o cianobacterias purificadas y su toxicidad se puede determinar preliminarmente basándose en la dosis medio letal (LD50 μg/kg). Excepto por unos pocos isómeros, la LD50 es de 200 a 250 μg/kg, y la de la mayoría de los MC es de 60 a 70 μg/kg. Este método es sencillo de utilizar y los resultados son intuitivos y rápidos, pero consume más toxinas y tiene baja sensibilidad y especificidad. La incapacidad de cuantificar y distinguir con precisión los tipos de isoformas de toxinas es costoso y requiere mucho trabajo. Por lo tanto, los métodos de experimentación con animales normalmente sólo se utilizan como métodos de detección preliminar para pruebas de toxicidad y son cada vez más reemplazados por otros métodos.

La tecnología de detección de citotoxicidad es una tecnología que utiliza el efecto tóxico de las toxinas en las células para detectar toxinas. No solo puede determinar si existen toxinas, sino también cuantificarlas con precisión. Gu Kangding et al. utilizaron un método de perfusión de dos pasos para preparar hepatocitos primarios de rata. Después del tratamiento con MC-LR, la morfología celular cambia después de varias horas y su sensibilidad puede alcanzar el nivel de μg/L. Fladmark et al. utilizaron la capacidad de las cianotoxinas para inducir la muerte de Salmonella y hepatocitos primarios de rata como parámetro para detectar MC-LR, demostrando que los hepatocitos de Salmonella en cultivo en suspensión proporcionan un sistema rápido y sensible para la detección de una amplia gama de hepatotoxinas. Aunque esta tecnología es muy sensible, su funcionamiento es complejo y básicamente se encuentra en una fase inicial de investigación, lo que dificulta su popularización y aplicación. La cromatografía líquida de alta resolución es uno de los métodos de análisis de MC más utilizados. En la naturaleza, el CM existe a menudo en cantidades mínimas y hay muchas sustancias que interfieren. Por lo tanto, antes de la detección cromatográfica, la muestra debe someterse a un tratamiento previo, como extracción, adsorción, enriquecimiento, purificación y elución, y luego realizar un análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento en el eluyente. Después de la detección por parte del detector, el tiempo de retención y el área del pico del cromatograma de la muestra se comparan con la muestra estándar para realizar análisis cualitativos y cuantitativos. Los principales detectores para la detección de MC por HPLC incluyen ultravioleta (UV o VWD), fluorescencia (FL), quimioluminiscencia (CL), matriz de diodos (PDA o DAD), etc. Los detectores más utilizados son los de rayos UV y los de diodos. MC es un polipéptido cíclico cuyo doble enlace de yugo * * * tiene una absorción máxima a 237 nm ~ 239 nm, que puede detectarse mediante luz ultravioleta. El costo de los detectores UV es bajo, pero la absorción característica de los isómeros de MC es muy cercana, lo que significa que los detectores UV tienen el defecto de interferencia mutua en el proceso de identificación de MC, lo que afecta la precisión de la determinación. Además, si se utiliza MC para eluir otras sustancias, se interferirán sus picos de absorción de longitud de onda única. Los detectores de matriz de diodos tienen una resolución más alta (con un rango de absorción espectral específico, generalmente de 190 nm a 280 nm), menor ruido y un rango lineal más amplio que los detectores UV de longitud de onda única. La desventaja es que la elección de la fase móvil es limitada y la longitud de onda de corte de la fase móvil debe ser menor que la longitud de onda de detección.

La cromatografía líquida de alta resolución puede determinar cualitativa y cuantitativamente el MC y es un medio importante para comprender las propiedades químicas e incluso la estructura del MC. Sin embargo, depende en gran medida de estándares de alta pureza y los estándares comerciales son muy limitados debido a limitaciones técnicas, lo que limita el desarrollo de la determinación de CM por HPLC.

La cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) utiliza la cromatografía líquida como sistema de separación y la espectrometría de masas como sistema de detección. La muestra de MC se separa de la fase móvil en la parte del espectrómetro de masas. Después de la ionización, el analizador de masas del espectrómetro de masas separa los fragmentos de iones y el detector obtiene el espectro de masas. Por lo tanto, siempre que se conozca la masa molecular relativa, la muestra se puede detectar de forma precisa y cuantitativa. La tecnología LC/MS se aplicó por primera vez a la detección de toxinas cianobacterianas en 1990.

HPLC-ESI-MS es un método de análisis por espectrometría de masas con un sistema de ionización por electrospray. El principio general es que la solución de muestra de MC se divide en muchas pequeñas gotas cargadas bajo la acción de un fuerte campo eléctrico, y los iones se desorben, se activan y se fragmentan en fragmentos mediante la colisión de iones, obteniendo así información de la estructura molecular.

Los iones moleculares y los iones fragmentados de la muestra ingresan al analizador de masas a través de una serie de separadores y lentes electrostáticos para análisis de espectrometría de masas. Este método se utilizó para la detección de CM en 1993.

Un espectrómetro de masas cuadrupolo consta de cuatro varillas exactamente paralelas con un voltaje de CC y un voltaje de radiofrecuencia superpuesto. Los pares de electrodos opuestos son equipotenciales y los potenciales entre los dos pares de electrodos son opuestos. Cuando un grupo de iones con diferentes relaciones masa-carga ingresan al campo eléctrico compuesto de CC y radiofrecuencia, solo los iones que cumplen ciertas condiciones oscilarán de manera estable a través del cuadrupolo y llegarán al monitor para su detección. Los espectros de masas se pueden obtener escaneando campos de radiofrecuencia. Los postes cuádruples son económicos y de bajo costo. Aunque el rango de relación masa-carga en el análisis diario solo puede llegar a 3000, debido a la alta presión permitida en el analizador, es muy adecuado para el modo de ionización ESI que genera iones a presión atmosférica. Además, la característica más destacada de la ionización ESI es la generación de cargas múltiples. La carga generada por la ionización por electropulverización MC se distribuye por debajo de 3000, por lo que el cuadrupolo y la ESI se utilizan ampliamente juntos. Además, el triple cuadrupolo puede realizar la detección de límites cuantitativos por espectrometría de masas de múltiples etapas.

La espectrometría de masas de iones de hidracina es un método de espectrometría de masas que utiliza iones de hidracina como analizador. La trampa de iones consta de un par de electrodos de anillo y dos electrodos de tapa de extremo hiperboloide. Aplique voltaje de radiofrecuencia o voltaje de CC al electrodo de anillo y los electrodos de la tapa del extremo superior e inferior se conectan a tierra. Al aumentar gradualmente el valor máximo del voltaje de RF, los iones ingresan a la región inestable y son expulsados ​​por los pequeños orificios en el electrodo de la tapa del extremo. Por lo tanto, cuando el valor máximo del voltaje de radiofrecuencia aumenta gradualmente, los iones con una relación masa-carga que varía de pequeña a grande se eliminan y registran para obtener un espectro de masas. La espectrometría de masas de iones de hidracina es muy conveniente para el análisis de espectrometría de masas de múltiples etapas y muy útil para la identificación de estructuras de sustancias. Zweigenbaum JA y otros utilizaron espectrometría de masas de iones de hidracina para estudiar el mecanismo de fragmentación de MC-LR, RR, etc. , utilizando tecnología de enriquecimiento de columna LC, introduciendo MC en el espectrómetro de masas cambiando la válvula y, finalmente, utilizando espectrometría de masas de iones de hidracina de múltiples etapas para analizar la fragmentación de sus iones originales y de iones fragmentados.

Referencia del espectro de masas de Microcystis.

La espectrometría de masas de tiempo de vuelo (TOF-MS) se basa en el principio de que iones de la misma energía tienen diferentes masas y diferentes velocidades. Utiliza una fuente de ionización de electrones, aplica un voltaje de extracción de pulso y luego acelera la velocidad de los iones a través de un electrodo acelerador y luego ingresa al tubo de deriva sin campo. Los iones de diferentes masas recorren la misma distancia de deriva hasta el receptor en diferentes momentos. La espectrometría de masas de tiempo de vuelo tiene las ventajas de una velocidad de escaneo rápida y una alta sensibilidad. El dispositivo tiene una estructura simple y no está limitado por el rango de masas. Pasquale Ferranti et al. utilizaron cromatografía líquida de alto rendimiento/espectrometría de masas en tándem de tiempo de vuelo de cuadrupolo por electropulverización (HPLC/ESI-Q-TOF-MS/MS) por primera vez para determinar MC-RR, -LR, -YR. , -LW y - en agua dulce, el límite de detección (LOQ) alcanza 0,1 μ g/L. Detección simultánea mediante espectrometría de masas en tándem de tiempo de vuelo por ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF-MS/MS). ) y espectrometría de masas en tándem de ion hidracina (trampa de iones-MS/MS) MC en agua dulce, los resultados muestran que HPLC/ESI-Q-TOF-MS/MS tiene alta sensibilidad, selectividad y reproducibilidad.

La cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) es una nueva categoría en la ciencia de la separación. Con la ayuda de la teoría y los principios de la cromatografía líquida de alto rendimiento, la UPLC cubre nuevas tecnologías como el empaquetado de partículas pequeñas, un volumen de sistema extremadamente bajo y métodos de detección rápidos, lo que mejora el rendimiento analítico, la sensibilidad y la capacidad máxima cromatográfica. En comparación con la cromatografía líquida de alto rendimiento tradicional, la velocidad, la sensibilidad y la resolución de la UPLC mejoran 9 veces, 3 veces y 65438±0,7 veces respectivamente. Wang Jing et al. utilizaron UPLC-MS/MS para detectar MC-LR, -RR, -LW y -LF en aguas superficiales en la provincia de Zhejiang. La tasa de recuperación es del 91,7% al 11% y la desviación estándar relativa es del 7,9% al 65438+. La cromatografía líquida tradicional requiere 30 minutos para separar estos cuatro MC, mientras que la UPLC solo tarda 3 minutos. Stuart A. Oehrle et al. utilizaron UPLC-MS/MS para detectar siete MC en agua dulce en solo 8 minutos, mientras que la detección por HPLC tardó 35 minutos. Las microcistinas se utilizan para inducir respuestas inmunitarias para producir anticuerpos, y el reconocimiento específico de antígenos por parte de los anticuerpos se utiliza para detectar diversas toxinas. Basados ​​en tecnología inmunológica, los métodos inmunoquímicos para la microcistina incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, el radioinmunoensayo, la cromatografía de inmunoafinidad, el método del oro coloidal y el método del inmunosensor. Este método tiene alta sensibilidad, procesamiento de muestras simple, fácil operación y un límite de detección inferior al nivel de la OMS. Es un método prometedor.

El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) se ha utilizado para analizar los CM desde que Kifir y Brooks informaron sobre anticuerpos monoclonales y policlonales contra las cianotoxinas a finales de los años 1980. Esta tecnología tiene las ventajas de una alta sensibilidad y una rápida velocidad de análisis. El principio del ELISA de competencia directa es recubrir anticuerpos anti-microcistina en una placa de múltiples pocillos, y la muestra de prueba, el estándar MC-LR y el MC-LR marcado con peroxidasa compiten por la unión a los anticuerpos en la placa de múltiples pocillos. El color producido por el sustrato catalizado por peroxidasa es inversamente proporcional a la concentración de MC-LR, es decir, el color oscuro indica una concentración baja de MC-LR y el color claro indica una concentración alta de MC-LR. También existe un método ELISA competitivo indirecto establecido recubriendo albúmina sérica bovina MC-LR en placas de múltiples pocillos y utilizando anticuerpos primarios y marcados. El ELISA de competencia indirecta es ligeramente más sensible que el ELISA de competencia directa.

El método de la proteína fosfatasa puede reflejar la cantidad total de diversas toxinas y tiene las ventajas de una alta sensibilidad de detección y un corto tiempo de medición. Serres et al. compitieron con toxinas de prueba no marcadas y MC-YR radiomarcadas con proteína fosfolipasa 2A (PP2A) y luego realizaron una filtración en gel después de alcanzar el equilibrio para separar las toxinas unidas a PP2A de las toxinas no unidas a PP2A, y luego detectar la radiactividad de las recolectadas. 125I-MC-YR-PP2A. Se obtiene en base a B/(Bo-B) (Bo es la actividad radiactiva 125I-MC-YR sin toxina, B es la actividad radiactiva 125I-MC-YR con toxina estándar o toxina a ensayar) y la concentración de estándar toxina La curva estándar se puede utilizar para calcular la cantidad de toxina que se va a analizar. Wong et al. exploraron el uso de métodos colorimétricos para detectar MC en agua. El experimento utiliza p-nitrofenol como sustrato y monitorea la tasa de producción del producto amarillo p-nitrofenol para indicar la actividad de la proteína fosfatasa 2A. Los resultados indican que el ensayo colorimétrico de inhibición de la proteína fosfatasa es una herramienta sencilla y económica para detectar MC con propiedades promotoras de tumores en agua.