Apéndice a de criterios de diagnóstico y principios de tratamiento para la brucelosis

(Suplemento) A1.1 Hemocultivo

A1.1.1 Cultivo en medio bifásico: muestras intravenosas estériles de pacientes sospechosos Tomar 4~5 ml de sangre e inyéctelo en 5 a 6 tubos de ensayo medianos que contengan medio de cultivo bifásico cerca de la llama de la lámpara de alcohol, o en 2 a 4 matraces que contengan medio de cultivo bifásico, mezcle suavemente e incline para obtener la sangre que se va a analizar Distribuya en agar inclinado y cultive en incubadora a 37 ℃. La mitad de las muestras deben cultivarse en un ambiente de CO (principio del subíndice) 2 (fin del subíndice). Después de tres días, si Brucella ya no crece, inclínelo nuevamente según el método anterior, extienda la sangre en el agar inclinado y continúe cultivando al día siguiente. Si hay colonias sospechosas de Brucella, se pueden inocular en medios de cultivo en tubos de ensayo con agar que contengan platino para obtener cultivos puros para una mayor identificación de Brucella. Después de 20 días de hemocultivo, Brucella todavía no producía.

A1.1.2 Inocular huevos no fertilizados: tomar dos huevos frescos, colocarlos en una rejilla fija, esterilizar las cáscaras con yodo y alcohol en secuencia y utilizar un bisturí oftálmico para perforar un pequeño agujero en la parte superior. Utilice una aguja de inyección de 3 cm de largo para inyectar lentamente la sangre que se va a analizar en la yema de huevo. Cada huevo se inocula con 0,2 ml de sangre. El orificio se sella inmediatamente con parafina esterilizada y se coloca en una incubadora a 37 °C para su cultivo. Después de 5 días, abrir asépticamente los huevos inoculados con sangre, utilizar un capilar estéril para aspirar de 0,5 a 0,6 ml de yema y clara de huevo, inocular en 2 a 3 medios de cultivo inclinados, cultivar a 37°C y observar cada 2 a 3 días. 3 días. Después de 15 días, no se encontró ningún crecimiento de colonias bacterianas sospechosas y la prueba se consideró negativa.

A1.2 Cultivo de médula ósea

La orina se drena con un catéter estéril y se coloca en un recipiente estéril. Para concentrar las bacterias y mejorar la tasa de detección, se pueden agregar a la orina de 1 a 3 sueros inmunes de Brucella de alto precio, mezclarlos, colocarlos en una incubadora a 37°C durante 2 horas, centrifugarlos a alta velocidad para precipitar y 0,5 Los ml del precipitado que se inocularon en la Brucella seleccionada pueden aislarse en medios biológicos o inyectarse en cobayas.

A1.3 Cultivar otras sustancias patógenas

Aislar Brucella de la leche, el líquido cefalorraquídeo, el líquido sinovial y el líquido sinovial, e inocular asépticamente la muestra líquida en una placa de cultivo o inclinada con agar y aplicar a la superficie del medio de cultivo. Los resultados del método de hemocultivo mostraron que todavía no había crecimiento de bacterias sospechosas después de 15 días y fue negativo.

A1.4 Aislamiento biológico de Brucella

Para mejorar la tasa de detección de Brucella, aísle Brucella de los materiales contaminados (las muestras sólidas y la solución salina esterilizada se muelen en una suspensión) y Se inyecta por vía subcutánea o intraperitoneal en conejillos de indias o ratones. Se inoculan los conejillos de indias con 1 ml, y los conejillos de indias se pueden inocular con 0,5 ml para observar la alergia al suero, y también se pueden aislar y cultivar bacterias. Los órganos de ratón se diseccionaron y cultivaron 20 días después de la infección, y los órganos de cobaya se diseccionaron y cultivaron 30 días después de la inoculación. A2.1 Prueba de aglutinación en placa (PAT)

A2.1.1 Equipos y reactivos

Placa de vidrio cóncava de Hudson o placa de vidrio limpia y sin grasa, placa de antígeno de aglutinación, suero de detección, negativo conocido y suero positivo, pipeta o micromuestreador de 0,1 ml, palillo o alambre fino.

A2.1.2 Método de operación

A2.1.2.1 Prepare una placa de vidrio limpia cuadrada y divídala en 25 cuadrados (o más), 5 cuadrados horizontales y 5 cuadrados verticales. Escriba el número de suero en cada cuadro de la primera columna.

A2.1.2.2 Utilice una pipeta de 0,1 ml para agregar suero a cada celda en cualquier fila (células horizontales) en la siguiente dosis: 0,08 ml para la primera celda, 0,08 ml para la segunda celda. La celda es de 0,04 ml, la tercera celda es de 0,02 ml y la cuarta celda es de 0,01 ml.

A2.1.2.3 Añadir 0,03 ml de antígeno de aglutinación en placa a cada célula del suero, mezclar con un palillo o alambre fino y mezclar a partir de las células con la menor cantidad de suero. Cada suero se puede mezclar con un palillo y quemar después de su uso. Si se mezcla con un alambre fino, cada suero se puede limpiar con una bola de algodón con alcohol después de mezclarlo y luego usarlo como otro suero.

A2.1.2.4 Después de mezclar, coloque la placa de vidrio sobre la llama de una lámpara de alcohol o una caja de reacción de aglutinación, caliéntela uniformemente a aproximadamente 30 °C y registre los resultados de la reacción dentro de los 5 minutos.

A2.1.2.5 Utilizar 1 suero negativo y 1 positivo como control para cada prueba.

A2.1.2.6 Registrar la intensidad de la reacción con un signo más según las siguientes normas:

: Aparecen grandes escamas aglutinadas o pequeñas partículas, el líquido es completamente transparente, 100 aglutinación. .

: Hay parches de aglutinación evidentes, el líquido es casi completamente transparente y la tasa de aglutinación es 75.

: La lámina de aglutinación es visible, el líquido es poco transparente y se aglutina al 50%.

: El líquido es turbio, con pocas partículas y un 25% de aglomeración.

-: El líquido es uniformemente turbio.

A2.1.2.7 La relación entre la aglutinación en placa y la aglutinación en tubo de ensayo;

El efecto de aglutinación de 0,08 ml de suero es equivalente a la dilución de suero de 1:25 en el tubo de ensayo método, y 0,04 ml equivalen a 1: 50, 0,02 ml equivalen a 1: 100, 0,01: 200.

A2.1.3 Juicio

El grado de aglutinación en 0,02 ml de suero humano y superiores se considera positivo, y el grado de aglutinación en 0,04 ml de suero humano y superiores se considera sospechoso .

A2.2 Prueba de aglutinación en placa de rojo tigre (RBPT)

A2.2.1 Equipos y reactivos

Portaobjetos limpios desnatados o con orificios empotrados Tabletas, 0,1 ml pipeta o micromuestreador, palillo de dientes o alambre fino, antígeno de aglutinación en placa de rojo tigre y suero a analizar.

A2.2.2 Método de operación

Agregue 0,03 ml de suero en el portaobjetos, luego agregue 0,03 ml de antígeno de placa de rojo tigre, agítelo con un palillo o mézclelo durante 5 minutos y determine el resultado en 5 minutos.

A2.2.3 Juicio

Juzgar el grado de aglutinación (-derecha, derecha) La reacción de aglutinación en placa también se puede dividir en () positiva y (-) negativa.

A2.3 Prueba de aglutinación en probeta (SAT)

A2.3.1 Equipos y reactivos

Antígeno de aglutinación en probeta, suero a analizar, ácido carbólico 0,5 solución, tubos de pipeteo, tubos de ensayo de aglutinación, incubadoras, gradillas para tubos de ensayo.

A2.3.2 Método de operación

A2.3.2.1 Dilución del suero a analizar: Generalmente, cada suero se diluye con 5 tubos de ensayo pequeños (diámetro 8 ~ 10 mm), al primer tubo agregue 2,3 ml de agua con ácido fénico, no lo agregue al segundo tubo, agregue 0,5 ml al tercer, cuarto y quinto tubo respectivamente y pipetee con una pipeta de 1 ml. Después de mezclar, use una pipeta para aspirar el suero en el primer tubo, agregue 0,5 ml al segundo y tercer tubo, mezcle el tercer tubo con una pipeta y luego succione 0,5 ml en el cuarto tubo y mezcle. Extraer 0,5 ml del cuarto tubo y desechar. Después de dicha dilución, las diluciones de suero del segundo tubo al quinto tubo son 1:12,5, 1:25, 1:50 y 1:100 respectivamente.

A2.3.2.2 Agregar antígeno: Primero, diluya adecuadamente la solución madre de antígeno con solución salina de ácido carbólico al 0,5 (generalmente 1:10). Agregue el antígeno diluido a cada tubo de suero diluido (no agregue el primer tubo como control de suero), agregue 0,5 ml a cada tubo y mezcle bien. Después de agregar el antígeno, el volumen total de cada tubo es de 1 ml. Las diluciones de suero del segundo al quinto tubo son 1: 25, 1: 50, 1: 100 y 1: 200 respectivamente. Se succionan los 0,5 ml restantes. el primer tubo.

A2.3.2.3 Control: Suero control negativo, el suero se diluye y luego se añade el antígeno (similar al suero control probado). Para un control de suero positivo, diluya el suero al título original, luego agregue el antígeno y el control de antígeno, y agregue el antígeno diluido apropiadamente al agua carbonatada.

A2.3.3 Juicio

A2.3.3.1 Determinación de la preparación del tubo turbidimétrico: Se debe preparar un tubo turbidimétrico para cada prueba como base para la medición. El método de preparación es: tomar de 5 a 10 ml del diluyente de antígeno utilizado en esta prueba, agregar una cantidad igual de 0,5 de agua carbonatada para diluir dos veces y preparar un tubo turbidimétrico de acuerdo con la Tabla A1.

Tabla A1 Preparación de tubos turbidimétricos

A2.3.3.2 Después de que todos los tubos de ensayo, los tubos de control y los tubos turbidimétricos estén completamente vibrados, colóquelos en una incubadora a 37 °C durante 20 a 22 horas Después de sacarlo, colocarlo a temperatura ambiente durante 2 horas y juzgar el resultado según el tubo turbidimétrico.

A2.3.3.3 Registrar los resultados: Registrar los resultados según el brillo del líquido superior en cada tubo. Especialmente el brillo 50 ( ) tiene una gran relación con el resultado del juicio y debe compararse con el medidor de turbidez.

: Aglutinación completa, sobrenadante 100% claro. : Casi completamente aglutinado, sobrenadante 75% transparente. : Aglutinación significativa y el líquido es 50% transparente. : Hay una ligera aglutinación y el líquido es 25% transparente. -: Sin aglutinación, el líquido no es claro.

El título de cada suero se determinó a la dilución de suero más alta en la que la aglutinación era 10 o más.

A2.4 Prueba de inmunoglobulina antihumana (COOMBS)

A2.4.1 Equipos y reactivos

Además del equipo y reactivos generales necesarios para la prueba prueba de aglutinación en tubo Además, se requiere suero anti-inmunoglobulina humana y una centrífuga universal.

A2.4.2 Método de operación

A2.4.2.1 Etapa de prueba de aglutinación en tubo de ensayo: Realizar la prueba de aglutinación en tubo de ensayo de acuerdo con A2.3.

A2.4.2.2 Etapa de reacción antiinmunoglobulina: seleccione los tubos de reacción sospechosos y todos los tubos de reacción negativos en la prueba de aglutinación en tubos de ensayo, registre el número de tubos, centrifugue a 4000 r/min durante 65438 ± 05 min. y enjuague con solución salina normal. Enjuague tres veces repetidamente, luego agregue 0,5 ml de solución salina fisiológica a cada tubo y agregue una cierta dilución (generalmente 1: 20 veces la dilución) de inmunidad antihumana.

A2.4.2.3 Juicio: Los estándares y el alcance de los resultados del juicio son los mismos que los de la prueba de aglutinación en tubo de ensayo.

A2.5 Prueba de fijación del complemento (CFT)

A2.5.1 Equipos y reactivos

Baño de agua a 37 ℃, centrífuga común, refrigerador común, varias pipetas volumétricas , matraz, tubo de aglutinación y tubo de ensayo, suero fisiológico, complemento (suero fresco de cuy o complemento liofilizado), suspensión de 2 glóbulos rojos de oveja, hemolisina, antígeno fijador del complemento, suero negativo y positivo y suero a ensayar.

A2.5.2 Método de operación

A2.5.2.1 Título del complemento: durante la CFT, el complemento debe titularse el mismo día y diluirse a 1:20 con solución salina normal. Por lo general, se añaden secuencialmente diferentes cantidades de complemento diluido 1:20 a diez tubos de aglutinación y luego se añaden a cada tubo entre 0,02 y 0,2 ml de dos unidades de solución de antígeno. Después de mezclar, colóquelo en un baño de agua a 37 °C durante 30 minutos, luego agregue 0,2 ml de hemolisina (2 unidades) y 0,2 ml de 2 glóbulos rojos, mezcle bien, colóquelo en un baño de agua a 37 °C durante 30 minutos y determinar el resultado (ver Tabla A2).

Tabla A2 Procedimiento de Titulación de Complemento y Resultados mL

En el ejemplo anterior, el tubo que produjo hemólisis completa y tuvo menor complemento fue el octavo tubo, que se define como unidades adecuadas, mientras que el tubo de ensayo anterior (es decir, el séptimo tubo de ensayo) es la unidad completa. En un experimento formal, el factor de dilución del complemento X se calcula utilizando dos unidades completas del complemento según la fórmula (A1).

20:2Y = X:0.2…………………………………………(a 1)

Entre ellos: y-1 reparación perfecta de la unidad .

A2.5.2.2 Titulación de hemolisina y antígeno: La hemolisina y el antígeno también deben titularse durante la CFT, pero no es necesario titularlos el día de la prueba y al comprar estos dos reactivos, las ventas; La unidad (o la unidad proporcionada) se ha titulado y las unidades requeridas se pueden diluir de acuerdo con las instrucciones.

A2.5.2.3 Inactivación del suero analizado: La temperatura de inactivación del complemento en suero humano es de 56°C durante 30 minutos.

A2.5.2.4 En esta prueba, el suero inactivado se diluye a partir de 1:5 y se diluye según la proporción múltiple. El volumen de suero diluido en cada tubo es de 0,2 ml, y luego 2 unidades de. Se agregan antígeno y 2 unidades de complemento a cada tubo, se mezcla bien, se coloca en un baño de agua a 37°C durante 30 minutos, se retira y luego se agregan 0,2 ml.

Tabla A3 Procedimiento de prueba CFT mL

A2.5.3 Juicio

: No hay hemólisis, SRBC se hunde hasta el fondo del tubo o está suspendido. :25 Hemólisis. :50 Hemólisis. :75 Hemólisis. -: 100 hemólisis. El título de CFT deberá ser 50( ) o superior sin hemólisis.

Para evitar errores de cálculo, se puede preparar un vaso sanguíneo estándar (consulte la Tabla A4).

Tabla A4 Preparación del estándar de disolución de vasos sanguíneos mL A3.1 Equipos y reactivos

Bacterias Bruce, 75 bolas de algodón con alcohol, jeringas de tuberculina, agujas para inyección intradérmica y reglas de medición.

A3.2 Método de operación

Desinfecte el tercio interno del antebrazo del paciente con un algodón con alcohol, séquelo e inyecte por vía subcutánea 0,1 ml de Brucella 24 horas después de la inyección. y observado dos veces en 48 horas.

A3.3 Juicio

Después de dos observaciones, prevalecerá el resultado con la reacción más fuerte y la congestión local del área de inyección será superior a 2,0 cm × 2,0 cm (o el área de reacción ≥ 4,0 cm (comienzo en superíndice) 2 (final en superíndice)), se considera positiva.

Notas adicionales:

Esta norma es encomendada por el Ministerio de Salud e interpretada por la Oficina de Supervisión y Gestión de la Prevención y Control de Enfermedades Infecciosas del Ministerio de Salud, punto focal técnico.