Introducción al ADN circulante

Los ácidos nucleicos circulantes fueron descubiertos por primera vez por Mandel y Metais en 1947 (Les acides nucl´eiques du plasma sanguin chez l'homme[J]. C R Hebd Seances Acad Sci (Paris), 1948, 142(3 ) : 241-3), pero debido a la falta de métodos experimentales altamente sensibles y específicos, la investigación sobre la correlación entre el ADN libre en la sangre y las enfermedades ha progresado lentamente durante un largo período de tiempo. Hasta la aparición de una tecnología eficaz para aislar el ADN libre y la aplicación de una tecnología de detección que combina tintes fluorescentes especiales con la tecnología de PCR, la investigación en este campo se ha desarrollado rápidamente en las últimas dos décadas. Desde el descubrimiento de que el ADN libre de células en la sangre puede contener las mismas mutaciones genéticas que el ADN de las células tumorales, ha habido un interés creciente en estudiar los ácidos nucleicos libres de células circulantes utilizando métodos de biología molecular. 1. Agregue 20 µl de solución de almacenamiento de proteinasa K a dos tubos de centrífuga de 1,5 ml (preparados por el usuario) y luego agregue 200 µl de la misma muestra de plasma.

*No añadir proteinasa K directamente a BufferVL.

2. Agregue 200 µl de BufferVL que contiene CarrierRNA y agite durante aproximadamente 15 segundos para mezclar.

3. Colocar el tubo de centrífuga en un baño de agua a 56°C durante 10 minutos.

4. Añadir 320?l de etanol absoluto, girar suavemente de 4 a 6 veces y mezclar uniformemente.

*Para evitar la contaminación cruzada entre muestras al abrir la tapa del tubo, centrifugue a baja velocidad durante unos segundos antes de abrir la tapa del tubo para permitir que la solución de la tapa del tubo se asiente en el fondo del tubo. .

5. Agregue un tubo de la mezcla del paso 4 a la columna de purificación de ácidos nucleicos (la columna de purificación de ácidos nucleicos se coloca en un tubo de centrífuga de 2 ml), cubra el tubo y centrifugue a 12.000 rpm durante 30 minutos. artículos de segunda clase.

*Tenga cuidado de que la solución no llegue al borde de la boca de la columna de purificación, de lo contrario la columna de purificación no se podrá limpiar en pasos de lavado posteriores.

6. Deseche el filtrado en el tubo de centrífuga de 2 ml, vuelva a colocar la columna de purificación de ácido nucleico en el tubo de centrífuga de 2 ml y agregue el otro tubo de mezcla del paso 4 a la misma columna de purificación de ácido nucleico.

*No es necesario desechar el filtrado por completo. Si desea evitar la contaminación de la centrífuga por el filtrado adherido a la boca del tubo de centrífuga, puede girar el tubo de centrífuga de 2 ml boca abajo sobre una superficie. toalla de papel y golpéela una vez.

7. Deseche el filtrado en el tubo de centrífuga de 2 ml, vuelva a colocar la columna de purificación de ácido nucleico en el tubo de centrífuga de 2 ml, agregue 500 µl de BufferWA a la columna de purificación de ácido nucleico, cubra el tubo y centrifugue a 12.000 rpm durante 30 segundos.

*Confirma que se ha añadido etanol absoluto a BufferWA.

8． Deseche el filtrado en el tubo de centrífuga de 2 ml, vuelva a colocar la columna de purificación de ácido nucleico en el tubo de centrífuga de 2 ml, agregue 700 µl de BufferWB a la columna de purificación de ácido nucleico, cubra el tubo y centrifugue a 12000 rpm durante 30 segundos.

*No es necesario desechar el filtrado por completo. Si desea evitar la contaminación de la centrífuga por el filtrado adherido a la boca del tubo de centrífuga, puede colocar el tubo de centrífuga de 2 ml boca abajo sobre una mesa. toalla de papel y golpéela una vez.

*Confirma que se ha añadido etanol absoluto al BufferWB.

9． Deseche el filtrado en el tubo de centrífuga de 2 ml, vuelva a colocar la columna de purificación de ácido nucleico en el tubo de centrífuga de 2 ml y centrifugue a 14.000 rpm durante 1 minuto.

*Si la velocidad de la centrífuga no puede alcanzar las 14000 rpm, centrifugue a la velocidad más alta durante 2 minutos.

*No omita este paso; de lo contrario, el ácido nucleico purificado podría mezclarse con etanol, lo que podría afectar los resultados de la PCR posteriores.

10. Deseche el tubo de centrífuga de 2 ml, coloque la columna de purificación de ácido nucleico en un tubo de centrífuga de 1,5 ml proporcionado por el kit, agregue 25-30 µl de BufferTE precalentado a 56 °C en el centro de la membrana de la columna de purificación y taparla. Tapar el tubo, dejar reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto y centrifugar a 12.000 rpm durante 30 segundos.

11. Deseche la columna de purificación y el ácido nucleico libre en plasma eluido se puede usar inmediatamente para la detección por PCR o RT-PCR, o el ácido nucleico libre en plasma se puede almacenar a -20 °C para su uso posterior. .