Los principales usos del isotiocianato de fenilo

El isotiocianato de fenilo (PITC) reacciona con el grupo amino N-terminal del polipéptido a analizar en condiciones alcalinas para generar un derivado de fenilaminotiocarboxamida (PTC), que luego se trata con ácido para eliminarlo selectivamente. La cadena se utiliza para obtener el derivado de anilina tiazolinona del residuo de aminoácido N-terminal. Luego los derivados se extraen con disolventes orgánicos. Bajo la acción del ácido, el derivado es inestable y continuará reaccionando para formar un derivado estable de fenilhidantoína tiourea (PTH). Los enlaces amida en la cadena peptídica restante no se ven afectados. Al realizar un análisis por HPLC o electroforesis en la fenilhidantoína tiourea (aminoácido PTH) producida, se puede identificar de qué aminoácido se trata. Después de cada reacción, se obtiene un polipéptido al que se le ha eliminado el residuo de aminoácido N-terminal y la cadena peptídica restante puede entrar en el siguiente ciclo para continuar con la degradación.

El método anterior se puede automatizar. Un analizador automático diseñado según este principio puede determinar de forma fiable la secuencia de aproximadamente 30 residuos de aminoácidos en una cadena peptídica y puede analizar hasta 50-60 residuos de aminoácidos. En condiciones óptimas, la eficiencia de generación de aminoácidos PTH puede permanecer por encima del 99% cada vez. Además, la cantidad de este método es muy pequeña. Generalmente, sólo se pueden utilizar de 10 a 100 picomoles de péptido para determinar la secuencia de aminoácidos. Para péptidos con cadenas peptídicas más largas, la cadena peptídica se puede cortar en varios péptidos pequeños, se puede realizar un análisis de aminoácidos en estos péptidos pequeños y luego se puede obtener la secuencia de aminoácidos en la cadena peptídica inicial empalmando esta información.

Debido a que la degradación de Edman se basa en la modificación del grupo amino N-terminal mediante reactivos químicos, cuando el extremo N-terminal está bloqueado por otros grupos químicos, estos grupos deben eliminarse antes de la secuenciación. Además, cuando las proteínas contienen residuos de cisteína, a veces dos residuos de cisteína se entrecruzan mediante enlaces disulfuro. En este caso, el enlace disulfuro debe oxidarse con perácido a –SO3H antes de que Edman pueda degradar la secuencia.