Introducción a los procedimientos de inspección de esterilidad para productos biológicos
Los productos biológicos no deben contener bacterias diversas (a menos que existan disposiciones especiales), y las vacunas y vacunas inactivadas no deben contener bacterias ni virus vivos. Durante el proceso de fabricación, el departamento de fabricación realiza pruebas de esterilidad de acuerdo con las normas de fabricación y verificación de varios productos, y finalmente el departamento de verificación de calidad verifica los productos reenvasados. A menos que se especifique lo contrario, las pruebas de esterilidad de diversos productos biológicos se realizarán de acuerdo con las disposiciones de este procedimiento.
2 Muestreo 1.1 Solución cruda y productos semiacabados.
Se debe inspeccionar la esterilidad de cada botella de solución cruda y producto semiacabado, y el volumen de muestreo debe ser de al menos 0,65438 ± 0 %, pero no menos de 65438 ± 0,0 ml.
1.1.1 Productos diluidos en tanques grandes El volumen de muestreo no será inferior a 10 ml.
1.1.2 Se deberán tomar muestras de soluciones crudas y productos semiacabados según lo anterior cada vez que se abran.
1.2 Productos terminados
Se debe inspeccionar la esterilidad de cada lote pequeño y las muestras deben seleccionarse al azar y ser representativas (incluidas muestras antes, durante y después del proceso de envasado).
1.2.1 Si la cantidad de embalaje es inferior a 100 piezas (botellas), no debe ser inferior a 5 piezas, ni inferior a 101 ~ 500 piezas (botellas) y 501.
1.2.2 Para hemoderivados liofilizados con una capacidad de frasco superior a 20 ml, se tomarán 2 frascos de cada gabinete con menos de 200 frascos, y de cada gabinete se tomarán 4 frascos con más de 200 botellas. Se duplicó el volumen de muestra de 6 ~ 20 ml. Se deben tomar muestras de 5 ml o menos de acuerdo con el punto 1.2.1.
1.3 Todos los productos que deban analizarse para detectar micoplasmas deben inspeccionarse en lotes como productos semiacabados y no deben convertirse en productos terminados.
3 Medio para pruebas de esterilidad (la prescripción del medio se puede adjuntar al Apéndice 1) 2.1 Se debe utilizar un medio adecuado para el desarrollo y crecimiento de las bacterias para comprobar si hay bacterias viables en el producto (a menos que existen disposiciones especiales).
2.2 Se debe utilizar medio de cultivo de tioglicolato para controlar las bacterias aeróbicas y anaeróbicas. Al inspeccionar bacterias aeróbicas y anaeróbicas en productos conservantes sin mercurio, no se puede agregar tioglicolato al medio de cultivo.
Se debe utilizar medio de Martin modificado para comprobar si hay moho y saprófitos.
Se puede utilizar medio de tioglicolato sin agar para comprobar si hay productos turbios. Cuando se prueban vacunas vivas, se puede aumentar el contenido de agar para crear una pendiente.
2.3 Para comprobar si hay micoplasma, se debe utilizar un medio de cultivo semisólido de jugo digestivo de estómago de cerdo o de jugo digestivo de corazón de res.
2.4 El medio de cultivo para pruebas de esterilidad de productos biológicos también se puede preparar con medio de cultivo seco verificado.
2.5 Medio de prueba estéril contra Streptococcus hemolítico tipo B (32210 cepas), Brevibacillus (7316 cepas), Clostridium sporogenes (64941 cepas) y Candida albicans (ATCC 6547). La sensibilidad debe alcanzar 108.
2.6 El departamento de inspección de calidad y el departamento de fabricación de medios de cultivo realizan conjuntamente pruebas de sensibilidad en los medios de cultivo utilizados para las pruebas de esterilidad de productos biológicos. Siempre que se reemplacen las materias primas principales, se debe realizar una prueba de sensibilidad y solo se pueden usar después de pasar la prueba (consulte los Apéndices 2 y 3 para conocer los métodos de prueba de sensibilidad).
2.7 El departamento de inspección de calidad de cada unidad de producción debe verificar periódicamente la sensibilidad del medio de prueba de esterilidad, y el instituto de inspección debe verificar periódicamente el medio de prueba de esterilidad.
4 Método de prueba de esterilidad 3.1 Todas las operaciones, como el muestreo y el trasplante de semillas en la prueba de esterilidad, deben realizarse en un quirófano estéril o en condiciones estériles. Los quirófanos estériles deben mantenerse limpios en todo momento y desinfectarse completamente antes de cada cirugía.
3.2 Las vacunas, vacunas, toxoides, productos antitoxina y hemoderivados viscosos que no sean fáciles de filtrar deberán ser directamente inoculados y esterilizados. La esterilidad de la albúmina sérica humana y la gammaglobulina de la sangre humana (incluidos los productos en diversas formas de dosificación y vías de aplicación) se analiza mediante el método de filtración por membrana. También se puede analizar la esterilidad de otros productos sanguíneos mediante el método de filtración por membrana o el método de inoculación directa.
3.3 Método de vacunación directa
3.3.1 Vacunas, vacunas, toxoides y productos antitoxinas
3.3.1.1 Cada tubo contiene más de 5,0 ml (excluyendo la ampolla la muestra que contiene 5,0 ml) no deberá ser inferior a 1,0 ml, la muestra de la ampolla que contenga menos de 5,0 ml (incluidos 5,0 ml) no deberá ser inferior a 0,5 ml y la ampolla que contenga menos de 0,5 ml deberá absorberse completamente.
3.3.1.2 Para productos que contienen conservantes, para productos que utilizan fenol o cloroformo como conservantes, la proporción entre el tamaño del inóculo y el medio debe ser al menos 1:20, para productos que utilizan mercurio como conservante o productos que contienen formaldehído y productos antibióticos, al menos 1:50. Primero inocular en medio de tioglicolato en esta proporción para el enriquecimiento, luego cultivar a 20 ~ 25 °C durante 3 ~ 4 días y luego transferir a medio de tioglicolato, agar inclinado adecuado y medio Martin modificado, cada uno 0,5 ml, medio de tioglicolato y agar inclinado apropiado en 1 tubo e incubar a 30 ~ 35°C, y los tubos restantes se incuban a 20 ~ 25°C. A menos que se indique lo contrario, el tiempo de incubación es de 8 días.
3.3.1.3 Para productos sin conservantes, mezclar cada 10 ampollas con un volumen de carga inferior a 5,0 ml (incluidos 5,0 ml), y mezclar cada 7 ampollas con un volumen de carga superior a 5,0 ml, e inocular el muestra mezclada directamente en un conjunto de medios de cultivo, cultivo a 20 ~ 25 ℃ y 30 ~ 35 ℃ respectivamente, el tiempo de cultivo es *.
3.3.1.4 Cuando utilice medio de cultivo de micoplasma, hierva el medio semisólido durante 10 a 15 minutos, luego enfríe a aproximadamente 56°C, agregue suero de caballo inactivado o suero de ternera inactivado y extracto de levadura (medio de cultivo , la proporción de suero y extracto de levadura es 7:2:1), agregue una cantidad adecuada de penicilina o extracto de levadura según corresponda.
3.3.1.5 Para productos que están turbios y el resultado no se puede determinar después de la inoculación, se puede inocular la cantidad especificada de muestra en medio de tioglicolato sin agar (200 ml) para cultivo de enriquecimiento bacteriano, 3 ~ Las semillas Se puede trasplantar después de 4 días. El tipo, cantidad y temperatura de incubación del medio de cultivo son los mismos que en 3.3.1.2. Los resultados se determinarán después de 8 días de incubación.
3.3.2 Hemoderivados
3.3.2.1 Tomar el número necesario de muestras, extraer muestras de cada frasco según la siguiente normativa e inocularlos todos.
Si el volumen de muestra por botella es inferior a 1,0 ml, tome la cantidad total; si la cantidad es inferior a 1 ~ 20 ml (excluidos 20 ml), tome 1,0 ml de medio de cultivo e inocule 1,0 ml.
Para muestras de menos de 5,0 ml por botella (no incluidas), las muestras de 100 ml y superiores se toman al 15% y se inoculan 5,0 ml por cada 40 ml de medio de cultivo.
La cantidad de medio de cultivo a inocular depende de la cantidad total de muestra. La proporción de inoculación de medio de tioglicolato a medio de Martin modificado fue de 2:1.
Después de la inoculación, la mitad del número total de medio de ácido tioglicólico debe cultivarse a 30 ~ 35 ℃, el resto debe cultivarse a 20 ~ 25 ℃ y el medio Martin modificado debe cultivarse a 20~25℃ durante no menos de 14 días.
3.4 Método de filtración por membrana
El tamaño de poro de la membrana del filtro es de 0,22 ~ 0,3 μm
Tome la cantidad requerida de muestras de muestreo y el volumen de la botella. es 65,438 Para muestras completas con un volumen de +000 ml y menos, tome la mitad de las muestras con un volumen de botella de 65,438+000 ml y más, agréguelas a un filtro de membrana esterilizado y filtre bajo presión o presión reducida. Si se trata de un conservante que contiene mercurio, después de filtrar la muestra, la membrana del filtro debe lavarse tres veces con solución salina fisiológica estéril u otros disolventes adecuados, 100 ml cada vez. Después de la filtración, retire asépticamente la membrana del filtro y coloque 2 piezas de medio de ácido tioglicólico y 1 pieza de medio Martin modificado (el volumen de cada pieza no es inferior a 40 ml y la altura no es inferior a 7 cm). Si utiliza un dispositivo de filtración, corte la membrana en tres partes iguales y coloque cada una en el medio designado. Después de colocar la membrana del filtro en el medio de cultivo, un medio de cultivo de tioglicolato se cultiva a 30~35 ℃ y el otro medio de cultivo se cultiva a 20 ~ 25 ℃. El tiempo de incubación no es inferior a 7 días.
Lo mejor es utilizar un recolector de bacterias con filtro microporoso desechable completamente cerrado, que requiere una capacidad de cultivo de 100 ml para cada incubadora.
3.5 Si es necesario calentar el medio para controlar las bacterias anaeróbicas para impulsar el oxígeno, se debe enfriar por debajo de 45 °C antes de la inoculación.
3.6 Los productos liofilizados deben diluirse según la dilución especificada en las instrucciones o etiquetas de los frascos, y luego someterse a una prueba de esterilidad.
5 Juicio 4.1 Si no hay crecimiento de bacterias extrañas, se considera calificado (a menos que se especifique lo contrario).
4.2 Si se encuentra crecimiento de bacterias diversas en la prueba de esterilidad, se puede volver a realizar la prueba. La cantidad de este producto debe duplicarse. Si las mismas bacterias aún crecen durante la nueva prueba, el producto se considerará no calificado. Si crecen diferentes bacterias, se puede realizar una segunda prueba, y la muestra de la nueva prueba debe tener el doble del tamaño de la primera. Si todavía hay crecimiento bacteriano, el producto se considera no calificado. Aquellos que den positivo para micoplasma no se volverán a realizar la prueba y el lote de productos se considerará no calificado.
4.3 Cuando el número de sublotes que no pasan la prueba de esterilidad del producto terminado representa más del 30% del lote total, el departamento de inspección de calidad trabajará con los departamentos pertinentes para desechar todo o parte de El lote según las circunstancias específicas.
6 Apéndice 1 Medio de inspección de esterilidad Prescripción 1 Medio de tioglicolato triptona (o solución de digestión con tripsina y caseína, 2000 mg basado en nitrógeno total) 15 g de extracto de levadura en polvo (o 200 ml de líquido de diálisis de levadura) 5 g de glucosa 5 g de cloruro de sodio 2,5 g de cistina (o clorhidrato de cisteína) 0,5 g de tioglicolato de sodio (o 0,6 ml de ácido tioglicólico) 0,5 g de agar 0,65 ~ 0,75 g de solución de resazurina al 0,1% recién preparada L) 1,0 ml de agua desionizada (o agua destilada), agregue 1000 ml de medio de tioglicolato (agar- libre) triptona (o solución de digestión con tripsina y caseína, nitrógeno total 2000 mg) 15 g de extracto de levadura en polvo (o 200 ml de líquido de diálisis de levadura) 5 g de glucosa, 5 g de cloruro de sodio, 2,5 g de cistina (o clorhidrato de cisteína), 0,5 g de tioglicolato de sodio (o 0,6 ml) 0,5 g de ácido tioglicólico Medio Martin glucosa 20 g de peptona 5 g de extracto de levadura en polvo (o dializado de levadura 100 ml) Se añaden 2 g de hidrogenofosfato dipotásico, 1 g de sulfato de magnesio (que contiene 7 moléculas de agua cristalina), 0,5 g de agua desionizada (o agua destilada) A 1000 ml, el pH final es 6,4 ± 0,24. Jugo digestivo de estómago de cerdo medio semisólido 500 ml 6543. 8+0:2 extracto de carne 500 ml de cloruro de sodio 2,5 g de glucosa 1 g de agar 3 ~ 4 g de jugo digestivo de corazón de carne 1000 ml de extracto de levadura 1 g de agar 3 ~ 4 g?
7Apéndice 2 Métodos de prueba de susceptibilidad para cepas de medio de prueba estéril 1 de bacterias anaeróbicas
1.1 Bacterias aeróbicas
Estreptococo B hemolítico (cepa 32210) y cepa Brevibacillus (cepa 7316) ).
1.2 Bacterias anaeróbicas
Clostridium sporogenes (cepa 64941).
Las cepas anteriores son distribuidas por el Instituto Chino para el Control de Productos Farmacéuticos y Biológicos.
2 Medio
Todos los medios (medios de enriquecimiento y medios de prueba) utilizados en las pruebas de esterilidad deben estar sujetos a pruebas de sensibilidad.
3 Funcionamiento
3.1 No se deben operar dos cepas de bacterias al mismo tiempo en el mismo quirófano estéril.
3.2 Inocular las bacterias en un medio adecuado y cultivarlas a 30 ~ 35 ℃ durante un cierto período de tiempo (24 ~ 48 horas para Streptococcus B hemolítico y Clostridium sporogenes, 18 ~ 20 horas para Brevibacterium horas) , luego raspe el Streptococcus B hemolítico y Brevibacterium en solución salina estéril para hacer una solución bacteriana uniforme. Clostridium sporogenes primero absorbe la solución bacteriana en un tubo de ensayo estéril y luego la usa. Luego realice una dilución en serie de 10 veces con agua de peptona al 0,1%.
3.3 Inocular 106 ~ 108 (Brevibacterium 106 ~ 108, Clostridium sporogenes 108 y Streptococcus hemolítico 109) a 9 ml respectivamente. Inocular al menos 3 tubos por dilución y utilizar medio no inoculado como control. El medio de cultivo inoculado con Streptococcus B hemolítico y Clostridium sporogenes se almacenó a 30 ~ 35 °C durante 3 días, y el medio de cultivo inoculado con Brevibacterium se almacenó durante 5 días y se registraron los resultados.
4 Juicio de resultados
La sensibilidad del medio de cultivo está determinada por la mayor dilución que supera el crecimiento de 2/3 de los tubos después de la inoculación, y la mayor sensibilidad alcanza el doble se determina mediante tres experimentos.
8Apéndice 3 Método de prueba de sensibilidad del medio de prueba de esterilidad de cepa del Molde 1
Candida albicans y cera de Cladosporium son distribuidos por el Instituto de China para el Control de Productos Farmacéuticos y Biológicos.
2 Moderado
Todos los medios utilizados en las pruebas de esterilidad del molde deben estar sujetos a pruebas de sensibilidad.
3 Operación
3.1 La sala estéril donde se opera el molde debe estar aislada de otras salas estériles. Cuando se analizan dos o más cepas de bacterias, no se deben realizar simultáneamente en el mismo quirófano estéril.
3.2 Inocule las bacterias en el medio de cultivo de papa y cultívelas a 20 ~ 25 °C durante 5 ~ 7 días. Luego lave el césped bacteriano con solución salina estéril y transfiéralo a un tubo grande lleno de vidrio. perlas para romper las esporas, filtrar a través de una jeringa llena de algodón absorbente. Diluya la solución bacteriana a la misma concentración que el medidor de turbidez estándar y luego realice una dilución en serie de 10 veces.
3.3 Inocular 1 ml de 105 ~ 107 líquido bacteriano en 9 ml de medio de prueba respectivamente. Inocular al menos 3 tubos para cada dilución. Utilizar el medio no inoculado como control y cultivar a 20 ~ 25°C durante 5. días, día a día observe los resultados.
Juicio de 4 resultados