Experimentos biológicos de ADN
2. Es mejor que el recipiente que contiene las células sanguíneas sea de plástico. Después de que las células sanguíneas de pollo liberan ADN roto, el recipiente de vidrio las absorbe fácilmente, porque el contenido de ADN en las células es relativamente pequeño. Si una parte es absorbida por el recipiente de vidrio, se puede extraer aún menos ADN. Por lo tanto, es mejor utilizar vasos de precipitados y tubos de ensayo de plástico durante los experimentos, lo que puede reducir la pérdida de ADN durante el proceso de extracción.
3. Pasos clave para obtener ADN más puro.
(1) Revuelva bien el líquido de células sanguíneas de pollo para asegurarse de que el ADN esté presente en el núcleo de las células sanguíneas de pollo. Después de mezclar la solución de células sanguíneas de pollo con agua destilada, se debe agitar rápidamente en una dirección con una varilla de vidrio para acelerar la ruptura de las células sanguíneas de pollo y liberar el ADN.
(2) Se debe utilizar alcohol frío para precipitar el ADN. Antes del experimento, se debe preparar una gran cantidad de alcohol con una fracción de volumen de 95 y almacenarlo en el refrigerador (al menos 5 S o menos) durante. al menos 24 horas.
(3) Para agitar correctamente la solución que contiene la suspensión, los pasos 3, 5 y 7 del experimento requieren agitar con una varilla de vidrio. Los profesores deben recordar a los estudiantes que en los pasos 3 y 5, la varilla de vidrio no se puede insertar directamente en el fondo del vaso y que la acción de agitación debe ser suave para obtener moléculas de ADN más completas. Paso 7: Inserte la varilla de vidrio en el centro de la solución en el vaso y gírela lentamente con la mano durante 5 a 10 minutos.
3. Referencias
Introducción complementaria a los principios experimentales
1. Liberación de ADN El ADN se encuentra en el núcleo de las células sanguíneas de pollo y no se libera en circunstancias normales. Para liberar el ADN del núcleo, agregue agua destilada a las células sanguíneas de pollo y revuelva. El agua destilada es un líquido hipotónico para las células sanguíneas de pollo. El agua puede ingresar a las células sanguíneas en grandes cantidades y provocar su ruptura. Al mismo tiempo, junto con la acción mecánica de la agitación, se acelera la ruptura (rotura de las membranas celulares y nucleares) de las células sanguíneas de pollo, liberando así ADN y, por supuesto, ARN. Sin embargo, el ADN y el ARN liberados tienden a unirse a proteínas en cantidades significativas.
2. La separación del ADN y la proteína se basa en las características de ambos, es decir, en una mayor concentración de solución de cloruro de sodio (la concentración de la sustancia es 2 mol/L), la proteína nuclear se separa fácilmente. se despolimeriza y se libera el ADN. El ADN es altamente soluble en soluciones de cloruro de sodio de mayor concentración, y el Na se combina con el ADN cargado negativamente para formar la sal de sodio del ADN. En este punto, el ADN se disuelve en la solución.
3. Precipitación y adquisición de ADN Utilice el principio de que el ADN tiene una pequeña solubilidad en una solución de cloruro de sodio de menor concentración. Agregue una gran cantidad (300 ml) de agua destilada a una solución de cloruro de sodio de mayor concentración. que contiene ADN La dilución de la solución de cloruro de sodio reduce la solubilidad del ADN y aumenta la solubilidad de las proteínas (este es el fenómeno de solubilización de la sal de las proteínas), lo que hace que los dos se separen. En este momento, junto con la agitación constante, el ADN con solubilidad reducida se vuelve gradualmente filamentoso. Filtra las proteínas y obtendrás la sustancia pegajosa del ADN. Si el método de centrifugación es mejor, centrifugue a 4000 r/min durante 15 minutos, retire el sobrenadante (que contiene proteínas) y deje el precipitado que contiene ADN.
4. Después de que el ADN se haya redisuelto, utilice una concentración más alta de solución de cloruro de sodio para disolver la mucosidad del ADN.
5. Precipitación y concentración del ADN La solución de ácido nucleico de la que se han eliminado las proteínas debe precipitarse y concentrarse aún más. El método más utilizado es la precipitación con alcohol.
Es decir, en una solución de ADN que contiene Na, agregue una solución de alcohol frío al 95% equivalente al doble de la fracción en volumen. Después de mezclar, el ADN se puede precipitar y concentrar para formar filamentos de ADN que contienen menos impurezas, que se suspenden en la solución. Si quedan menos hebras, enfriar la mezcla en el frigorífico unos minutos. Los filamentos de ADN condensados se pueden enrollar girando lentamente la varilla de vidrio (ya que la varilla de vidrio absorberá el ADN).
6. Identificación del ADN El método para identificar el ADN en este experimento es el método de la difenilamina (consulte "Preparación del fármaco" a continuación para obtener la receta). El principio del método de la difenilamina es: los nucleótidos de purina en el ADN generan ω-hidroxi-γ-cetoglutaraldehído en ácido desoxirribosa, que reacciona con la difenilamina y se vuelve azul (la solución se vuelve azul claro).
La profundidad del color azul de la solución está relacionada con el contenido de ADN en la solución.
Preparación del reactivo de difenilamina
Líquido A: Disolver 15 g de difenilamina en 100 mL de ácido acético glacial, luego agregar 15 mL de ácido sulfúrico concentrado y almacenar en una botella marrón. Si el ácido acético glacial ha cristalizado, es necesario calentarlo hasta que se derrita antes de usarlo.
Líquido B: La fracción en volumen de acetaldehído es 0,2.
Preparación: Añadir 0,1 mL de solución B a 10 mL de solución A y ya está listo para su uso.
Otro método crudo de extracción e identificación del ADN
1. Materiales Instrumentos
Coliflor fresca (o ajo, espinacas).
Vaso de precipitados de plástico, probeta medidora, varilla de vidrio, gasa de nailon, mortero de porcelana, tubo de ensayo, gradilla para tubos de ensayo, gradilla para tubos de ensayo, embudo, lámpara de alcohol, red de amianto, trípode, cerillas, cuchilla, balanza.
Líquido de molienda, solución de alcohol con fracción volumétrica 95, reactivo de difenilamina y agua destilada.
2. Pasos del método
(1) Extracción bruta de ADN
①Preparación del material: Se colocan coliflor fresca y una solución de alcohol con una fracción de volumen de 95. el frigorífico congelador al menos 24 horas.
② Muestra del material: Pesar 30 g de coliflor, quitarle los tallos y picar en trozos pequeños.
③Molienda Colocar las azucenas picadas en un mortero, verter 10 mL de líquido de molienda y triturar durante 10 minutos.
④Filtro: coloque una gasa de nailon en el embudo, filtre el líquido de molienda de las azucenas y viértalo en un vaso de precipitados (las escuelas con condiciones pueden verterlo en un tubo de centrífuga de plástico para centrifugar a una velocidad de 1 000 r/min. centrifugar durante 25 min, tomar el sobrenadante y ponerlo en un vaso de precipitados). Colocar el sobrenadante en un vaso de precipitados). Refrigerar el sobrenadante en un frigorífico a 4°C durante unos minutos y luego sacar el sobrenadante.
⑤Agregue alcohol frío. Vierta el doble del volumen del sobrenadante en el doble del volumen de una solución de alcohol frío al 95% y revuelva suavemente la solución con una varilla de vidrio (la varilla de vidrio no se puede insertar directamente en el fondo de la botella). el vaso). Después de 35 minutos de precipitación, apareció un flóculo de ADN blanco. Gire la varilla de vidrio lentamente y el flóculo se enrollará alrededor de la varilla.
(2) Identificación del ADN
①Preparación del reactivo de difenilamina Tome 0,1 ml de la solución B, colóquelos en 10 ml de la solución A y mezcle bien.
② Identificación: Poner 4 mL de solución de extracción de ADN en un tubo de ensayo, agregar 4 mL de reactivo de difenilamina, mezclar bien y observar el color de la solución (no se torna azul). Calentar al baño maría hirviendo (100°C) durante 10 minutos. Durante el proceso de calentamiento, preste atención al cambio de color de la solución en el tubo de ensayo (gradualmente se vuelve azul claro).
Método de preparación del líquido de molienda
Tris: 10,1 g (masa molecular relativa: 121,14), disolver en 50 mL de agua destilada, ajustar el pH a 8,0 con ácido clorhídrico, la concentración es 2 mol/L y luego agregue los siguientes medicamentos.
NaCl: 8,76 g (masa molecular relativa 58,44)
EDTA: 37,2 g (masa molecular relativa 372,24)
SDS: 20 g (masa molecular relativa 288,3 )
Después de disolver todos los medicamentos anteriores, use agua destilada para preparar una solución de 1000 ml.
Cuando la temperatura ambiente es inferior a 20 °C, el SDS precipitará. En este momento, es necesario aumentar la temperatura para disolver el SDS. Si hay precipitado en el fluido de molienda preparado de antemano, se debe elevar la temperatura para disolver el precipitado antes de su uso.
Efectos de varios fármacos en el líquido de molienda
SDS (dodecilsulfato de sodio): Puede desnaturalizar las proteínas y separarlas del ADN.
EDTA (etilendiaminotetraacetato disódico): Es un inhibidor de la DNasa y puede evitar que la DNasa degrade el ADN tras la alteración celular.
La concentración de sustancia de la solución de cloruro de sodio es de 0,15 mol/L: puede disolver bien el ADN.
Tris/HCl: Proporciona un sistema tampón en el que se estabiliza el ADN. Tris/HCl: proporciona un sistema tampón que estabiliza el ADN. (Tris es tris(hidroximetil)aminometano)
Otros métodos de identificación del ADN La irradiación ultravioleta es muy eficaz para identificar el ADN. El método de identificación específico es el siguiente.
1. Prepara el tinte. Prepare una solución de 5 partes por millón de bromuro de etidio (EB) en agua destilada.
2. Limpie el flóculo blanco envuelto alrededor de la varilla de vidrio sobre papel encerado y luego agregue 1 gota de solución EB para teñir.
3.
3. Coloque el papel encerado debajo de una lámpara UV (260 nm) y se verá una fluorescencia de color rojo anaranjado (el pico de absorción UV del ADN está a 280 nm). ).