Características del Resgrain
1 Telómero
1.1 El concepto de telómero
El telómero se refiere a la proteína-ADN especial al final del cromosoma lineal de las células eucariotas. La estructura, que Es decir, múltiples repeticiones de la secuencia de ADN al final del cromosoma, su función es proteger y estabilizar el extremo del cromosoma. Consta de secuencias repetidas de segmentos cortos en tándem de 2 a 20 kb (TTAGGG) y algunas proteínas de unión. La estructura del telómero de Tetrahymena (organismo unicelular) son múltiples repeticiones de la secuencia 5′-TTGGGG-3' de 6 nucleótidos. Los humanos tienen múltiples repeticiones de la secuencia 5′-TTAGGG-3′. A medida que las células continúan dividiéndose, el número de replicaciones cromosómicas aumenta y la secuencia de ADN de los telómeros se acorta progresivamente. Por tanto, la longitud del telómero determina la vida útil de la célula. Cuando alcanza una determinada longitud, la célula detiene la diferenciación y sufre una muerte programada (apoptosis). Los telómeros sirven como "reloj de mitosis" de la célula y regulan la división celular. La longitud de los telómeros del envejecimiento prematuro es significativamente más corta que la de las personas normales, mientras que la longitud de los telómeros de las espermatogonias humanas es miles de kb más larga que la de las células somáticas y no disminuye con la edad [2].
1.2 Estructura y función de los telómeros
En 1978, Blackbum descubrió que el ADN telomérico del cromosoma de Tetrahymena, un organismo unicelular de estanque, es un gran número de secuencias de nucleótidos simples. Repita, es decir, (TTGGGG) n. Posteriormente se demostró que los telómeros de humanos y vertebrados son secuencias de ADN repetitivas ricas en guanina (G). El ADN de los telómeros humanos está compuesto por unidades repetidas de ADN de telómeros 5′. Siempre se combina con proteínas no histonas para formar un complejo. Aunque su estructura no está clara, desempeña un papel importante en la protección de los extremos de los cromosomas para que no sean degradados por las nucleasas, evitando que los extremos de los cromosomas se pierdan y fusionen y participando en el proceso de fusión. cromosomas en el núcleo. Posicionamiento interno y regulación de la expresión génica, manteniendo así la estabilidad del sistema genético.
2 Telomerasa
2.1 El concepto de telomerasa
Kim et al. (1994) establecieron un método para el análisis estable, por lotes y rápido de telómeros en diversos tejidos. El método Trap de actividad enzimática es un método de análisis de amplificación repetida de ADN desarrollado por Kim et al., quienes utilizaron inteligentemente la tecnología de PCR. Se sabe poco sobre la regulación de la actividad de la telomerasa. Bcl-2, un factor de supervivencia que regula la apoptosis, puede tener una función reguladora positiva sobre la activación de la telomerasa.
2.2 Estructura y función de la telomerasa
La telomerasa es una ADN polimerasa dependiente de ARN. Actualmente se cree que consta de tres partes: componente de ARN de telomerasa, proteína relacionada con la telomerasa y catalizador de la telomerasa. subunidad. El gen de la telomerasa humana está ubicado en 5P15·33, que codifica un polipéptido de 1132 aminoácidos. Es una transcriptasa inversa que utiliza ARN como plantilla. Sintetiza múltiples secuencias repetidas teloméricas reconociendo el cebador de la región rica en G de la monocatenaria. telómero hasta el extremo 3′, por lo que la telomerasa tiene la función de regeneración de los telómeros. En las primeras etapas del desarrollo embrionario humano, la actividad de la telomerasa se puede detectar en muchos tejidos. Sin embargo, a medida que los tejidos y las células humanas se diferencian, la actividad de la telomerasa disminuye rápidamente. En los adultos, sólo unas pocas células o líneas celulares, incluidas las células germinales, todavía tienen telomerasa. Tiene actividad telomerasa y ya no es detectable en la mayoría de las células somáticas.
3 Método para medir la actividad de la telomerasa
El método inicialmente estándar para detectar la telomerasa era analizar la capacidad de extractos celulares para sintetizar secuencias repetitivas en el extremo 3′ 2 del cebador. A través de la observación del marcaje de nucleótidos radiactivos, electroforesis en gel de poliacrilamida y autorradiografía, los resultados mostraron que la reacción enzimática de la telomerasa mostró una naturaleza pulsante de la síntesis de 6 nucleótidos, formando así un intervalo típico de mapa de patrón de bandas de telomerasa. Aunque es difícil detectar la telomerasa en muestras de tumores primarios con este método, dos grupos de investigación lograron utilizar esta tecnología para confirmar la presencia de telomerasa activada en extractos de cáncer epitelial de ovario y carcinoma de células hematopoyéticas malignas [3]. Además, algunas personas han utilizado sondas específicas marcadas radiactivamente para la hibridación in situ para detectar la presencia o ausencia de telomerasa mediante la detección de niveles de expresión de ARN en células de tejido [4]. Los 46 cromosomas normales de las células humanas tienen 92 telómeros. La telomerasa se puede detectar indirectamente midiendo la longitud promedio de los telómeros cromosómicos en células de diferentes tipos de tejidos.
La longitud del ADN de los telómeros generalmente se mide mediante análisis de fragmentos de restricción de extremos cromosómicos e hibridación Southern utilizando (TTA GGG) 4 como sonda. La desventaja de este método es que la longitud de los telómeros en células inmortales no refleja verdaderamente la actividad de la telomerasa. activo. En la actualidad, el método de amplificación de secuencia repetida de telómeros establecido por Kim et al. se utiliza principalmente para medir la actividad de la telomerasa. Este método utiliza dos tecnologías innovadoras para mejorar en gran medida la sensibilidad del análisis de la telomerasa (aumentada 104 veces). El primero es la preparación y el pretratamiento del extracto, utilizando detergente para lisar las células y extraer la telomerasa eficaz de una pequeña cantidad de células (el método antiguo utilizaba la lisis hipotónica, el principal avance es permitir que la telomerasa se amplifique el producto de la reacción); exponencialmente. Esta amplificación se realiza aplicando un cebador catalizado por telomerasa, el producto de la reacción de extensión se utiliza como plantilla para la PCR y, mediante síntesis continua de ADN utilizando oligonucleótidos como cebadores, el producto amplificado se somete a electroforesis para reflejar la actividad enzimática de los telómeros. Los dos pares de cebadores involucrados en este método son: el cebador directo es 5' 2AA TCCGTCGA GCA GA GTT2 3' y el cebador inverso es 5' 2 (CCCTTA) 3 CCCTAA 2 3'. Este método es sensible, rápido y eficiente, pero es susceptible a interferencias de diversos factores externos y contaminación isotópica. Recientemente, Iwama et al. han mejorado el método TRA P, utilizando el método de amplificación de repetición de telómeros fluorescentes estándar del ensayo interno de telomerasa, que puede superar esta deficiencia y puede realizar un análisis semicuantitativo, que es ideal para detectar la actividad de la telomerasa.
4 Diagnóstico y tratamiento de la telomerasa y los tumores
Dado que la actividad de la telomerasa se encuentra en la mayoría de los tumores malignos, pero esta actividad enzimática no se encuentra en las células somáticas humanas normales, la actividad de la telomerasa trae esperanza para el Diagnóstico y tratamiento de tumores malignos. En primer lugar, se espera que la detección de la actividad de la telomerasa se convierta en un marcador para el diagnóstico precoz de tumores malignos y el juicio del pronóstico tumoral. Por ejemplo, la detección de la actividad de la telomerasa se puede utilizar como marcador para detectar tumores malignos tempranos. Si las células cancerosas metastásicas se pueden separar de las células de sangre periférica, también se puede usar como marcador para el cáncer metastásico temprano. Alrededor del 20% al 30% de los casos de cáncer de mama sin metástasis en los ganglios linfáticos axilares no tienen actividad de telomerasa, y la tasa de detección de actividad de la telomerasa en casos de cáncer de mama con metástasis en los ganglios linfáticos axilares supera el 95%, lo que indica que las enzimas de telomerasa se pueden utilizar como indicadores independientes. para juzgar el pronóstico y la recurrencia del cáncer de mama [5]. El análisis de telomerasa del tejido antes de la cirugía puede proporcionar a los cirujanos más información, y el análisis sensible de la telomerasa se puede utilizar en la aspiración de tejido con aguja fina, lo que permite determinar el pronóstico del paciente antes de la cirugía. En segundo lugar, dado que la actividad de la telomerasa es una enzima esencial para mantener el crecimiento continuo de la mayoría de las células tumorales malignas, los fármacos anticancerígenos basados en la inhibición de la actividad de la telomerasa pueden lograr altos efectos terapéuticos y efectos secundarios mínimos. La función de la telomerasa en las células germinales y otras células permanentemente viables es mantener la longitud de los telómeros para que las células puedan seguir dividiéndose. En la actualidad, parece que esta enzima es un objetivo relativamente específico y claro para el tratamiento del cáncer [6-9]. Aunque se debe considerar que la inhibición de la actividad de la telomerasa en las células tumorales también inhibe la actividad de la telomerasa en las células germinales y en las células madre hematopoyéticas, se espera que este tratamiento tenga menor toxicidad y efectos secundarios que los tratamientos actuales, además de su efecto sobre las células madre, con la quimioterapia habitual. Actúa sobre todas las células en proliferación. Los inhibidores de la telomerasa pueden reducir o evitar efectos secundarios como náuseas y caída del cabello causados por la quimioterapia convencional. Hay que tener en cuenta que los inhibidores de la telomerasa deben haber acortado los telómeros hasta cierto punto antes de que se active la telomerasa para que puedan ejercer su efecto, por lo que puede pasar algún tiempo. Al diseñar el uso de este inhibidor de enzimas para tratar tumores, primero debemos intentar acelerar el acortamiento de los telómeros en las células tumorales para que el inhibidor pueda surtir efecto lo antes posible para lograr el propósito de tratar tumores.
5 Resumen preliminar de la investigación genética sobre la telomerasa
Aún no se comprende todo el gen que codifica la holoenzima de la telomerasa. Sin embargo, actualmente se cree que la telomerasa es una ADN polimerasa dependiente de ARN, y que la subunidad de la telomerasa funciona utilizando ARN como plantilla para sintetizar fragmentos de ADN telomérico. Este gen plantilla de ARN que codifica la telomerasa se ha clonado en muchos organismos, incluidos los humanos. Además, también se identificaron tres proteínas relacionadas con la activación de la telomerasa: P80, P95 y TP1. Las proteínas P80 y P95 se han purificado de Tetrahymena ciliata. Se ha clonado con éxito el gen que codifica la proteína TP1 de los mamíferos, que es similar a la P80. Actualmente se desconocen las funciones exactas de estas proteínas en la telomerasa. La secuencia de aminoácidos de la proteína TP1 de los mamíferos es muy similar a la de la proteína Tetrahymena P80.
La proteína TP1 exhibe unión específica al ARN de telomerasa de mamíferos. La reacción de inmunoprecipitación entre el antisuero TP1 y los extractos celulares con actividad telomerasa sugiere que TP1 está estrechamente relacionado con la telomerasa in vivo.
En resumen, en los últimos años, la investigación sobre los telómeros y la telomerasa ha atraído un gran interés por parte de los biólogos moleculares. La predicción de la estructura tridimensional de las enzimas, la clonación de genes y la aparición de la línea germinal han logrado ciertos avances. [10～12]. Con base en la elucidación de los mecanismos de interacción entre varias moléculas que afectan la longitud de los telómeros, se cree que la investigación sobre los telómeros y la telomerasa tendrá amplias aplicaciones en la extensión de la vida útil de las células, la detección, el diagnóstico y el tratamiento de tumores y las perspectivas de la terapia génica.