¿La nitrato reductasa tiene isoenzimas? ¿Cuál es el mecanismo de síntesis de la nitrato reductasa y cuáles son los factores que afectan su síntesis?

Principio de determinación de la actividad de la nitrato reductasa La nitrato reductasa es una enzima clave en el metabolismo del nitrógeno de las plantas. Es simple y fácil de absorber y utilizar el nitrógeno junto con los cultivos en condiciones normales. Colorante azoico rojo. La alta acidez de la solución de reacción aumenta la velocidad de diazotización, pero reduce la velocidad de acoplamiento y el color es relativamente estable. Aumentar la temperatura puede aumentar la velocidad de reacción, pero reducirá la estabilidad de la sal de diazonio, por lo que la reacción debe llevarse a cabo en las mismas condiciones. Este método es muy sensible y puede determinar 0,5 microgramos de nitrito de sodio por mililitro. Instrumento Medicina Espectrofotómetro 721 Bomba de vacío (o jeringa) Incubadora Balanza Secador de vacío Taladro Matraz Erlenmeyer Pipeta Vaso de precipitados Tampón fosfato 0,1 mol/L, pH 7,5 (consulte la Tabla 2). 0,2 mol/L de nitrato de potasio: Disolver 20,22 gramos de nitrato de potasio en 1000 ml de agua destilada. Reactivo de sulfonamida: Añadir 1 g de sulfonamida a 25 ml de ácido clorhídrico concentrado y diluir a 100 ml con agua destilada. Reactivo de α-naftilamina: disolver 0,2 g de α-naftilamina en agua destilada que contenga 1 ml de ácido clorhídrico concentrado y diluir a 100 ml. Solución estándar de nitrito de sodio: disolver 1 g de nitrito de sodio en agua destilada hasta obtener 1000 ml. Luego aspirar 5ml y agregar agua destilada para diluir a 1000ml. Esta solución contiene 25 microgramos de Nano por ml y debe diluirse a tiempo. Pasos de operación 1. Lave las hojas frescas (ricino, tabaco, girasol, colza, trigo, algodón, etc.) con agua, séquelas con papel absorbente, luego perfórelas en discos con un diámetro de aproximadamente 1 cm y enjuáguelas dos veces con agua destilada, seque y luego pese dos hojas del mismo peso en una balanza de mesa, aproximadamente dos porciones cada una. Colóquelos en matraces Erlenmeyer de 50 ml que contengan las siguientes soluciones: (1) 5 ml de solución tampón de fosfato de 0,1 mol/L (pH 7,5) + 5 ml de agua destilada (2) solución tampón de fosfato de 0,1 mol/L (pH 7,5); 5ml+0,2mol/L KNO3 5ml. Luego coloque el matraz Erlenmeyer en un desecador de vacío, conecte la bomba de vacío para extraer aire y el disco se hundirá en la solución después de desinflarlo (si no hay bomba de vacío, puede usar una jeringa de 20 ml, vierta la solución de reacción y deje la hoja). disco en la jeringa y use Bloquee el orificio de salida de la jeringa con el dedo y luego tire de la jeringa con fuerza para generar vacío, de modo que el aire del disco sea succionado y se hunda en la solución). Coloque el matraz Erlenmeyer en una incubadora a 30°C y manténgalo caliente durante 30 minutos. Luego preste atención a la fotosíntesis de las hojas durante un período de tiempo para acumular carbohidratos antes del muestreo. Si el contenido de carbohidratos del tejido es bajo, se reducirá la actividad enzimática. En este momento, se pueden añadir 30 µg de fosfato de 3-gliceraldehído o fructosa-1,6-bifosfato a la solución de reacción para aumentar significativamente la temperatura durante 30 minutos. Pipetear 1 ml de la solución de reacción en un tubo de ensayo, agregar 2 ml de reactivo de sulfonamida y 2 ml de reactivo de α-naftilamina, mezclar y agitar bien, dejar reposar durante 30 minutos y utilizar un colorímetro para la medición colorimétrica. 3. Dibujar una curva estándar está relacionado con la velocidad de diazotización y acoplamiento. Tanto la temperatura como la concentración de ácido afectan la velocidad de desarrollo del color y la sensibilidad. Pero si los estándares y las muestras se miden en las mismas condiciones, la velocidad de desarrollo del color es la misma. Pipetee 1 ml de soluciones de NaNO2 de diferentes concentraciones (como 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 μg/ml) en el tubo de ensayo, agregue 2 ml de reactivo de sulfonamida y 2 ml de reactivo de α-naftilamina, mezcle y agite, y dejar reposar 30 minutos (o dejar reposar 30 minutos en agua a cierta temperatura), y medir inmediatamente con un espectrofotómetro. Luego, tome la absorbancia como ordenada y la concentración de NaNO2 como abscisa. Dibuje una curva de absorbancia-concentración en un milímetro cuadrado de papel. Experimento 1. Intente comparar las actividades enzimáticas de diferentes plantas. 2. Antes del muestreo, intente comparar las diferencias en la actividad enzimática de las plantas en condiciones de luz u oscuridad. Referencia 1. Chen Wei y Zhang Deyi: 1980. Extracción, determinación y purificación de nitrato reductasa de tejidos vegetales, Plant Physiology Communications, 1980 (4): 45-49. Zhou Shu y Zheng Xiangmu: 1985. Discusión sobre métodos de análisis in vivo de nitrato reductasa, Plant Physiology Letters, 1985 (1): 47-49. Hagman, R.H. y D.P. Huckabee: 1971. Métodos en enzimología, 23A:491-503. Radin JW: 1973. Fisiología vegetal, 51: 332–336.5. Snell, FD y CT Snell: 1949.

Análisis colorimétrico, Volumen 2, 802-807 (Zhang Zhiliang, Universidad Normal del Este de China) Referencias:

http://218.63.248.165/RESOURCE/CZ/CZSW/SWSY/ZWSLSY /3019 _ SR.