Puntos clave de la separación de fases
Sólo una pequeña proporción de secuencias de proteínas tienen la capacidad de formar separación de fases en las células vivas.
IDR es un dominio estructural común en proteínas separadas en fases. La secuencia primaria a menudo determina la capacidad de cambio de fase, el factor impulsor, la concentración crítica y la viscoelasticidad de estas proteínas. Las características de secuencia que pueden afectar la separación de fases incluyen la longitud, el número y el patrón de las IDR, así como las características de las IDR y las secuencias entre las IDR. Los determinantes típicos incluyen la composición y el patrón de aminoácidos hidrofóbicos. Aunque el contenido de aminoácidos hidrófobos en IDR es relativamente pequeño, representan componentes adhesivos en la separación de fases y la concentración de la separación de fases se ajusta según los cambios de temperatura. Los aminoácidos cargados también influyen en la formación de la separación de fases, mediante la cual pares de proteínas con cargas opuestas precipitan como aglomerados complejos.
Inferir IDRs en proteínas para analizar su capacidad de separación de fases.
Además, cabe destacar que el PTM es muy importante para la separación de fases. Generalmente, las proteínas expresadas y purificadas por bacterias tienen pocas modificaciones postraduccionales, mientras que las proteínas purificadas a partir de células eucariotas generalmente tienen buenas modificaciones postraduccionales. Se recomienda realizar una identificación por espectrometría de masas de modificaciones postraduccionales de proteínas expresadas en eucariotas antes de los experimentos para garantizar la reproducibilidad del experimento y ayudar a comprender el mecanismo molecular específico de separación de fases de la proteína.
Durante el proceso de purificación, generalmente es necesario evitar la separación de fases de la proteína objetivo. Sin embargo, si se produce una separación de fases, se puede volver a disolver bajo ciertas condiciones, o la proteína se puede purificar usando este método. separación y disolución de fases repetidas.
La proteína purificada necesita ser identificada mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas, y se debe identificar su pureza. Recomendamos que las proteínas se almacenen en tampones sin separación de fases. Los tampones deben mantener un pH neutro y deben utilizar concentraciones altas o muy bajas de iones de sal para evitar la separación de fases. Al mismo tiempo es necesario añadir un agente reductor. Los sistemas tampón comúnmente utilizados son los siguientes (sistema tampón de pH: HEPES 50 mM pH 7,5, iones de sal: NaCl 300 mM o KCl 500 mM, o sin iones de sal, agente reductor: TCEP 1 mM o DTT 5 mM). Recomendamos envasar la proteína, congelarla rápidamente en nitrógeno líquido y luego almacenarla criogénicamente. No congelar ni descongelar proteínas, ya que la congelación y descongelación provocarán agregación de proteínas y desnaturalización parcial, afectando sus propiedades. Al realizar experimentos de separación de fases, cabe señalar que para cada proteína, es necesario optimizar las condiciones correspondientes, como el pH, la concentración de iones de sal y la temperatura, para acercarlas lo más posible a las condiciones fisiológicas. Para obtener algunos consejos detallados, se recomienda al lector leer otro artículo (Alberti et al., 2018) Guía del usuario para ataques de separación de fases con proteínas purificadas.
La separación de fases es muy sensible a los cambios de condiciones físicas y químicas. Pequeñas diferencias en la temperatura, las proteínas, los ácidos nucleicos o la concentración de sal también pueden conducir a resultados diferentes. Por lo tanto, los experimentos de separación de fases in vitro deben controlar con precisión el sistema tampón y la concentración de proteínas.
En experimentos de separación de fases se suelen utilizar algunos compuestos poliméricos, como polietilenglicol, dextrano o polietilenglicol. En muchos casos, la cantidad de Claude agregada a un experimento puede exceder el ambiente presente en la célula. Actualmente se desconoce el mecanismo exacto por el cual Clode promueve la separación de fases, por lo que Clode debe usarse con precaución. Si se usa crowder, recomendamos usar una variedad de crowders en experimentos para eliminar los resultados falsos positivos causados por crowder (en privado escuché a un maestro mencionar que cuando Crowder está presente, se pueden separar alrededor de 80 proteínas).
En el sistema experimental de separación de fases in vitro, se puede determinar si LLPS cambia la actividad de la enzima, estudiando así la importancia biológica de la separación de fases. En algunos experimentos in vitro, generalmente es necesario agregar altas concentraciones de sustancias químicas de moléculas pequeñas (como inhibidores de quinasa, inhibidores de metiltransferasa, etc.) al sistema de separación de fases. En este momento, se debe considerar que estas altas dosis de sustancias químicas de moléculas pequeñas, además de sus propios efectos sobre la actividad enzimática, también pueden tener un efecto directo sobre la separación de fases, afectando así a la actividad enzimática.
In vitro, la IDR suele ser suficiente para mediar la separación de fases.
Ejemplos de IDR con separación de fases de alta concentración: IDR de Ddx4, LAF-1, FUS, hnRNPA1 y Whi3. Estos resultados indican que estos IDR pueden impulsar de forma independiente la separación de fases a través de interacciones homotípicas. Cada vez hay más evidencia que sugiere que la separación de fases también puede ser impulsada por interacciones heterogéneas con otras regiones del mismo polipéptido u otras proteínas.
¿Se puede entender que la IDR es una condición suficiente para que se produzca la separación de fases, más que una condición necesaria?
Una de las dificultades actuales en el campo de la separación de fases es cómo identificar si algunas estructuras especiales en las células realmente se forman mediante separación de fases. En determinadas condiciones in vitro, cuando la concentración es suficiente o el tampón es adecuado, algunas proteínas y el ARN se separarán en fases. A menudo, al sobreexpresar estas proteínas en las células, se observa que se forma una gran estructura esférica y se puede inferir que la proteína aún formará una separación de fases en concentraciones bajas en la célula, pero no se puede detectar con microscopía óptica ordinaria. Sin embargo, la separación de fases requiere una concentración suficiente para que se produzca, por lo que se debe considerar el efecto de la sobreexpresión exógena cuando se utilizan proteínas sobreexpresadas para detectar la separación de fases. Mientras tanto, deberíamos intentar encontrar otras formas, además de la sobreexpresión, para demostrar que la separación de fases efectivamente ocurre en las células.