Principio de eliminación de óxido electroforético

2. La tecnología básica de la electroforesis en gel de agarosa para separar ácidos nucleicos. En una determinada concentración de medio de gel de agarosa, la movilidad electroforética de las moléculas de ADN es inversamente proporcional al logaritmo común de su peso molecular; la configuración también afecta la migración La tasa tiene un impacto, como valencia ADN circular cerrado > ADN lineal > ADN bicatenario circular abierto. Cuando la concentración del gel es demasiado alta, el tamaño de los poros del gel se vuelve más pequeño, el ADN circular (esférico) no puede entrar en el gel y la movilidad relativa es 0, mientras que el ADN lineal (en forma de varilla rígida) del mismo tamaño puede avanzar en el gel. dirección del eje largo y la movilidad relativa es 0. La tasa de migración es mayor que 0.

⑴ Equipos y reactivos: La electroforesis en gel de agarosa se divide en dos tipos: vertical y horizontal.

Entre ellos, el tipo horizontal puede preparar gel de agarosa de baja concentración, y la preparación del gel y la adición de muestras son más convenientes, por lo que se usa ampliamente. La separación de ácidos nucleicos generalmente utiliza un sistema tampón continuo. Los más utilizados incluyen TBE (0,08 mol/l Tris·HCl, pH 8,5, 0,08 mol/l ácido bórico, 0,0024 mol/l EDTA) y THE (0,04 mol/l Tris·HCl). pH 7, 8, 0,2 mol/l de acetato de sodio, 0,0018 mol/l de EDTA).

⑵ Preparación del gel: use el tampón anterior para preparar una solución de gel de agarosa al 0,5%-0,8%, caliéntelo en un baño de agua hirviendo o en el microondas para derretirlo y agregue bromuro de etidio (EB) cuando se enfríe a 55°C La concentración final es de 0,5 μg/ml y luego se inyecta en el molde ensamblado con placas de vidrio o placas de vidrio orgánico. El espesor depende de la concentración de la muestra. Al inyectar pegamento, el extremo inferior de los dientes del peine debe estar a una distancia de 0,5 a 1,0 mm de la placa de vidrio. Después de la decoagulación, saque el peine y agregue una cantidad adecuada de tampón de electrodo para que el pegamento de la placa quede sumergido 1 mm debajo del tampón.

⑶ Preparación y adición de muestras: Las muestras disueltas en TBE o THE deben contener colorante indicador (0,025% azul o naranja de bromofenol), sacarosa (10%-15%) o glicerina (5%-10%). También puede usar Fico Ⅱ al 2,5% para aumentar la gravedad específica para concentrar la muestra, y se pueden agregar de 5 a 10 μg a cada perforación.

⑷Electroforesis: El voltaje general es de 5-15V/cm. El voltaje disponible para la separación de macromoléculas es de 5V/cm. El proceso de electroforesis se lleva a cabo mejor en condiciones de baja temperatura.

⑸Recuperación de la muestra: después de la electroforesis, observe la separación de la muestra bajo luz ultravioleta. Las moléculas de ADN requeridas o fragmentos especiales se pueden recuperar del gel después de la electroforesis mediante diferentes métodos, como el lavado por electroforesis. Método de desorción: corte. Saque el gel que contiene la zona de ácido nucleico bajo luz ultravioleta, colóquelo en una bolsa de diálisis (que contiene una cantidad adecuada de tampón de electroforesis nuevo), ate bien la bolsa de diálisis y colóquela plana entre los dos electrodos del tanque de electroforesis horizontal. la solución tampón poco profunda, electroforesis a 100 V durante 2-3 horas, luego intercambie los electrodos positivo y negativo y realice electroforesis inversa durante 2 minutos para liberar el ADN en la bolsa de diálisis. Aspire la solución que contiene ADN y realice extracción con fenol, precipitación con etanol y otros pasos para completar la recuperación de la muestra.

Otros métodos incluyen el método de agarosa de bajo punto de fusión, el método de lixiviación con solución de acetato de amonio, el método de extrusión por congelación, etc., pero todos los métodos solo son beneficiosos para la recuperación de fragmentos de ADN de pequeño peso molecular (<1kb). el peso molecular aumenta, la cantidad recuperada disminuye significativamente.

(3) Tecnología de electroforesis por enfoque isoeléctrico

El enfoque isoeléctrico (IEF) se introdujo a mediados de los años 60 y utiliza un medio con un gradiente de pH para separar puntos isoeléctricos con diferentes técnicas de electroforesis de proteínas. . Dado que su resolución puede alcanzar 0,01 unidades de pH, es particularmente adecuado para separar componentes proteicos con pesos moleculares similares pero diferentes puntos isoeléctricos.

⒈Principios básicos de IEF En la electroforesis IEF, el medio con un gradiente de pH se distribuye desde el ánodo al cátodo, y el valor del pH aumenta gradualmente. Como se mencionó anteriormente, las moléculas de proteína tienen las características de disociación anfifílica y punto isoeléctrico. De esta manera, en la región alcalina, las moléculas de proteína se cargan negativamente y se mueven hacia el ánodo, pierden su carga y dejan de moverse hasta alcanzar un cierto punto de pH. El pH del medio aquí es exactamente igual al punto isoeléctrico (pl) de la molécula de proteína enfocada. De la misma manera, las moléculas de proteínas ubicadas en regiones ácidas se mueven hacia el cátodo con cargas positivas hasta enfocarse en su punto isoeléctrico. Se puede ver que en este método, el punto isoeléctrico es una medida característica de los componentes proteicos. Se añaden mezclas de proteínas con diferentes puntos isoeléctricos al medio de gel con un gradiente de pH, después de un cierto período de tiempo en el campo eléctrico, cada componente. Se centrará en Las bandas de proteínas separadas se forman en las posiciones de pH correspondientes a sus respectivos puntos isoeléctricos.

2. Composición del gradiente de pH Hay dos formas de formar un gradiente de pH. Una es el gradiente de pH artificial, que ya no se utiliza debido a su inestabilidad y poca repetibilidad. El otro es el gradiente natural de pH. El establecimiento de un gradiente de pH natural consiste en introducir una serie de mezclas de electrolitos anfóteros cuyos puntos isoeléctricos estén próximos entre sí entre los electrodos positivo y negativo de una placa horizontal o tubo de electroforesis, inhalar soluciones ácidas como el ácido sulfúrico, el ácido fosfórico o el ácido acético. ácido en el extremo positivo e introduzca álcali en el extremo negativo líquido, como hidróxido de sodio, amoníaco, etc. Antes del inicio de la electroforesis, el pH de la mezcla de electrolitos anfóteros es un valor promedio, es decir, el pH en cada sección del medio es igual, representado por pH0.

Después de que comienza la electroforesis, la molécula con el pH más bajo en la mezcla tiene la carga más negativa, pI1 es su punto isoeléctrico y se mueve más rápido hacia el electrodo positivo. Cuando se mueve hacia la interfaz ácido-líquido cerca del electrodo positivo, el pH cambia repentinamente. cae, incluso cerca o ligeramente por debajo, en PI1, esta molécula ya no avanza y permanece en esta región. Debido a que el electrolito anfótero tiene cierta capacidad amortiguadora, el pH del medio en un área determinada a su alrededor se mantiene dentro de su rango de punto isoeléctrico. El segundo anfolito con un pH ligeramente superior, cuyo punto isoeléctrico es pI2, también se mueve hacia el electrodo positivo, ya que pI2>pI1 se sitúa detrás del primer anfolito. el anfolito con diferentes puntos isoeléctricos es pI2. Los electrolitos anfóteros están dispuestos en secuencia según sus respectivos puntos isoeléctricos, formando un gradiente de pH lineal con puntos isoeléctricos crecientes desde el electrodo positivo al electrodo negativo, de bajo a alto, como se muestra en la Figura. 16-3.

⒊Portador anfólito y medio de soporte El portador anfótero ideal debe tener suficiente capacidad tampón y conductancia en pI. El primero garantiza la estabilidad del gradiente de pH y el segundo permite el paso de una cierta cantidad de corriente. Los anfolitos con diferente pI deben tener coeficientes de conductividad similares para que la conductividad de todo el sistema sea uniforme. El peso molecular del electrolito anfótero debe ser pequeño y es fácil separarlo de la sustancia polimérica separada mediante un tamiz molecular o un método de diálisis, y no debe reaccionar con la sustancia separada ni desnaturalizarla.

Los medios de soporte de gradiente de pH comúnmente utilizados incluyen gel de poliacrilamida, gel de agarosa, gel de dextrano, etc., entre los cuales el gel de poliacrilamida es el más utilizado.

Después de la electroforesis, los tintes no se pueden utilizar para tinción directa, porque los tintes de proteínas de uso común también pueden combinarse con anfolitos. Por lo tanto, el gel debe empaparse en ácido tricloroacético al 5% para eliminar los anfolitos y luego teñirlo. de manera apropiada.

(4) Otras técnicas de electroforesis

⒈El método de electroforesis bidimensional IEF/SDS-PAGE fue establecido por O′Farrall et al en 1975 basándose en la diferencia en el punto isoeléctrico y el punto molecular. Se realizó electroforesis bidimensional IEF/SD S-PAGE. Entre ellos, la electroforesis IEF (forma de columna) es la primera dimensión y SDS-PAGE es la segunda dimensión (placa). Al realizar electroforesis IEF de primera dimensión, se debe agregar al sistema de electroforesis urea de alta concentración y una cantidad adecuada de detergente no iónico NP-40. Además de estas dos sustancias, las muestras de proteínas también deben contener ditiotreitol para promover la desnaturalización de las proteínas y el estiramiento de la cadena peptídica.

Después de la electroforesis IEF, agite y equilibre el gel cilíndrico en la solución de tratamiento de muestras utilizada para SDS-PAGE (que contiene SDS, β-mercaptoetanol) y luego inclúyalo en el gel de SDS-PAGE. encima de la placa de gel, se puede realizar una electroforesis bidimensional.

La electroforesis bidimensional IEF/SDS-PAGE es extremadamente precisa en la separación de proteínas (incluidas proteínas ribosómicas, histonas, etc.), por lo que es especialmente adecuada para separar componentes proteicos complejos en bacterias o células.

2. Electroforesis capilar Neuhoff et al. establecieron un método para analizar trazas de proteínas utilizando geles capilares de concentración uniforme y gradiente de concentración, a saber, electroforesis en gel de microcolumnas. Para geles de concentración uniforme, el capilar se sumerge en. el gel en la mezcla de gel, llene el gel con aproximadamente 2/3 del volumen total, luego presiónelo sobre una almohadilla de arcilla sustituta de aproximadamente 2 mm de espesor, selle el fondo del tubo y use un vidrio duro con un diámetro menor que. el tubo capilar que contiene el gel. El capilar absorbe agua y la deposita sobre el gel. Después de la polimerización, retire la capa de agua y agregue una solución de proteína (0,1-1,0 μl, concentración 1-3 mg/ml) al gel usando un tubo capilar. Llene el espacio del tubo capilar con tampón de electrodo, corte la parte insertada en el. arcilla, y luego la electroforesis está lista.

La actual aparición de los analizadores de electroforesis capilar, especialmente el cromatógrafo de electroforesis de alto rendimiento de American Biosystems, proporciona una forma rápida y eficaz de separar y recuperar macromoléculas biológicas como fragmentos de ADN, proteínas y péptidos. La cromatografía de electroforesis de alto rendimiento combina la resolución de la electroforesis en gel con la tecnología de cromatografía líquida rápida. Cuando la muestra se eluye del gel, un flujo continuo de eluyente transporta los componentes separados a través de un detector en línea, muestra los resultados e imprime. archivos. La cromatografía de electroforesis de alto rendimiento no solo tiene las ventajas de alta resolución y biocompatibilidad inherentes a la electroforesis en gel, sino que también puede eluir muestras de manera conveniente y continua.

Para cada método de electroforesis, a menos que se especifique lo contrario, opere de acuerdo con los siguientes métodos.

1. Método de electroforesis en papel 1. El dispositivo del instrumento incluye una cámara de electroforesis y una fuente de alimentación de CC.

El dispositivo de cámara de electroforesis horizontal comúnmente utilizado se muestra en la figura, que incluye dos tanques de electroforesis A y una cubierta de vidrio sellable (o material correspondiente) B, los tanques de electroforesis en ambos lados están divididos en dos partes con placas de plexiglás (o material correspondiente) C; El compartimento exterior está equipado con un electrodo de platino (diámetro 0,5 ~ 0,8 cm) D; el compartimento interior es un soporte para tanque de electroforesis de plexiglás F que puede contener el papel de filtro E. Este soporte se puede sacar del tanque; D en los tanques de electroforesis A en ambos lados están aislados. Los cables pasan a través de la pared del tanque y están conectados a la fuente de alimentación del instrumento de electroforesis externo. La fuente de alimentación es una fuente de alimentación de CC con un regulador de voltaje. La electroforesis de voltaje normal generalmente está entre 100 y 500 V, y la electroforesis de alto voltaje generalmente está entre 500 y 10 000 V.

2. Método de operación (1) Tampón de electroforesis tampón citrato (pH3.0) Tome 39,04 g de ácido cítrico (C6H8O7·H2O) y 4,12 g de citrato de sodio (C6H5Na3O7·2H2O) g, agregue 4000 ml de agua para disolver. (2) Papel de filtro: Tome el papel de filtro cromatográfico y sumérjalo en una solución de ácido fórmico de 1 mol/L durante la noche. Sáquelo al día siguiente, enjuáguelo con agua hasta que el valor de pH de la solución de lavado no sea inferior a 4 y séquelo. Llevar al horno a 60°C y reservar. El papel de filtro se puede cortar a una longitud de 27 cm y un ancho de 18 cm según sea necesario, o según el tamaño de la cámara de electroforesis. Dibuje una línea inicial de 5 a 8 cm desde un extremo de la longitud y marque cada 2,5 a 3 cm. propósitos de muestra. (3) Existen métodos de punto húmedo y de punto seco para detectar manchas. El método de la mancha húmeda consiste en sumergir todo el papel de filtro cortado en tampón de citrato (pH 3,0). Después de que esté húmedo, sáquelo, use el papel de filtro para absorber el exceso de tampón y colóquelo en la rejilla del tanque de electroforesis para que el papel de filtro se absorba. La línea de inicio está cerca del ánodo. En el extremo, sumerja ambos extremos del papel de filtro en el tampón y luego use una microjeringa para agregar con precisión la solución de prueba, 10 μl por punto, máximo 3 puntos, y deje 2 posiciones en blanco. El método de la mancha seca consiste en manchar la solución de prueba en el papel de filtro, secar con secador y luego manchar nuevamente, repitiendo varias veces hasta que se manche la cantidad especificada de la solución de prueba, luego usar un rociador para humedecer el papel de filtro y finalmente rociar. el lugar donde está la muestra. Este método es adecuado para la solución de prueba diluida. (4) Para electroforesis, agregue una cantidad adecuada de tampón de electroforesis al tanque de electroforesis, sumerja el electrodo de platino, encienda la fuente de alimentación regulada del instrumento de electroforesis, ajuste el gradiente de voltaje a 18 ~ 20 V/cm, electroforesis durante aproximadamente 1 hora y 45 minutos, sáquelo y séquelo inmediatamente con secador. Verifique con luz ultravioleta (254 nm) y use un lápiz para marcar la ubicación de las manchas moradas. (5) Determinación del contenido: corte las manchas de la muestra de prueba y el papel de filtro en blanco con un área similar a las manchas, córtelas en tiras finas y colóquelas en tubos de ensayo respectivamente. Agregue 5 ml de solución de ácido clorhídrico de 0,01 mol/L a cada uno. con precisión, agitar bien y dejar reposar 1 hora. Usar 3 Filtrar a través de un embudo de vidrio fundido vertical, o usar sedimentación natural o centrifugación para verter el sobrenadante, medir la absorbancia de acuerdo con las normas de cada fármaco y calcular el contenido. basado en el coeficiente de absorción.

2. Método de electroforesis de película fina de acetato de celulosa 1. Instrumentos y equipos: la cámara de electroforesis y la fuente de alimentación de CC son los mismos que los de la electroforesis en papel.

2. Reactivos (1) Tampón barbitúrico (pH 8,6), tomar 2,76 g de barbitúrico y 15,45 g de barbitúrico sódico, añadir agua y disolver hasta obtener 1000 ml. (2) Solución de tinte negro amino: tomar 0,5 g de negro amino 10B y disolverlo en una mezcla de 50 ml de metanol, 10 ml de ácido acético glacial y 40 ml de agua. (3) Solución de enjuague: tomar 45 ml de etanol, 5 ml de ácido acético glacial y 50 ml de agua y mezclar bien. (4) Líquido transparente: tomar 25 ml de ácido acético glacial, añadir 75 ml de etanol absoluto y mezclar bien. 3. Método de operación (1) Película de acetato de celulosa: Tome la película de acetato de celulosa, córtela en tiras de 2 cm x 8 cm, coloque el lado mate hacia abajo, sumérjala en tampón barbitúrico (pH 8,6), espere hasta que esté completamente empapada y retire. Sujételo en el papel de filtro, absorba suavemente el exceso de tampón, coloque el lado mate de la tira de membrana hacia arriba, colóquelo en la rejilla del tanque de electroforesis y sumérjalo en tampón de barbitúricos (pH 8,6) a través del puente de papel de filtro. (2) Manchado y electroforesis: en la tira de membrana a 2 cm del extremo negativo, deje caer de 2 a 3 µl de la solución de prueba con un contenido de proteína de aproximadamente el 5 % en forma de tira y realice la electroforesis bajo un gradiente de potencial de 10 a 12V/cm. La distancia adecuada entre zonas de electroforesis es de 4 a 5 cm. (3) Teñido Después de la electroforesis, retire la tira de membrana y sumérjala en una solución de tinción de negro amino. Después de 2 a 3 minutos, enjuáguela varias veces con una solución de enjuague hasta que se elimine el color de fondo. (4) Transparencia: Remoje la tira de película lavada y completamente seca en un líquido transparente durante 10 a 15 minutos, luego sáquela y colóquela sobre una placa de vidrio limpia. Después del secado, se convierte en una película transparente, que se puede medir. y se realizan en un espectrofotómetro. Las muestras se almacenan durante largos períodos de tiempo.

(5) Determinación del contenido El patrón de electroforesis de la película de acetato de celulosa sin tratamiento transparente se puede determinar de acuerdo con el método especificado para cada fármaco. Generalmente, se utiliza el método de elución o el método de escaneo para determinar el contenido porcentual relativo de cada componente proteico. Método de elución: Seque la tira de membrana lavada con papel de filtro, corte las zonas de electroforesis de cada patrón de electroforesis de la solución de prueba, sumérjalas en una solución de hidróxido de sodio al 1,6% y agite varias veces hasta que se complete la elución. una determinada longitud de onda. Al mismo tiempo, corte la parte libre de proteínas correspondiente a la tira de membrana del producto de prueba y opere de la misma manera que un control. Calcule primero el valor de absorción total y luego calcule el porcentaje de cada componente proteico. El método de escaneo utiliza un escáner cromatográfico para dibujar automáticamente una curva de cada componente proteico en un registrador mediante reflexión (película no transparente) o transmisión (película transparente) de una película de acetato de celulosa seca. La abscisa es la longitud de la tira de película. La ordenada es la absorbancia y se calcula el contenido porcentual de cada componente proteico. También se puede utilizar una microcomputadora para procesar el cálculo integral.

3. Método de electroforesis en gel de agarosa 1. Instrumentos y equipos: la cámara de electroforesis y la fuente de alimentación de CC son los mismos que los de la electroforesis en papel.

2. Reactivos (1) Tampón ácido acético-sal de litio (pH 3,0) Tomar 50 ml de ácido acético glacial, añadir 800 ml de agua, mezclar, ajustar el pH a 3,0 con hidróxido de litio y añadir agua. a 1000ml. (2) Solución de azul de toluidina: tomar 0,1 g de azul de toluidina y añadir 100 ml de agua para disolver. 3. Método de operación (1) Para hacer gel, tome aproximadamente 0,2 g de agarosa, agregue 10 ml de agua, caliéntelo en un baño de agua para que se hinche por completo, agregue 10 ml de tampón de sal de litio y ácido acético tibio (pH 3,0). , mezclar bien y ponerlo en el gel mientras esté caliente. Aplicar la solución de pegamento sobre una placa de vidrio de tamaño adecuado (2,5 cm × 7,5 cm o 4 cm × 9 cm) con un espesor de unos 3 mm y dejar reposar hasta que se endurezca. El gel forma una capa fina uniforme y sin burbujas. (2) Preparación de solución estándar y solución de prueba según las disposiciones de cada fármaco. (3) Manchado y electroforesis Agregue tampón de sal de acetato de litio (pH 3,0) al tanque de electroforesis, coloque la placa de gel en el marco del tanque de electroforesis y sumérjala en el tampón a través del puente de papel de filtro. Coloque 1 μl de cada muestra en el extremo negativo de la placa de gel, encienda la alimentación inmediatamente, realice la electroforesis durante aproximadamente 20 minutos en condiciones de un gradiente de voltaje de aproximadamente 30 V/cm y una intensidad de corriente de 1 a 2 mA/cm. y luego apague la alimentación. (4) Tinción y decoloración: retire la placa de gel, tiña con solución de azul de toluidina y lave el exceso de solución de tinción con agua hasta que el fondo sea incoloro.

IV.Método de electroforesis en gel de poliacrilamida 1. La instrumentación suele consistir en un instrumento de electroforesis de flujo estacionario y un tanque de electroforesis de disco o placa plana. La cámara de electroforesis tiene dos tanques, superior e inferior, y cada tanque tiene un electrodo de platino fijo. El electrodo de platino está conectado al deflector de flujo constante del instrumento de electroforesis a través de un cable aislado.

2. Reactivo (1) Solución A: Tomar 36,6 g de trishidroximetilaminometano y 0,23 ml de tetrametiletilendiamina, añadir 48 ml de solución de ácido clorhídrico de 0,1 mol/L, añadir agua para disolver y diluir a 100 ml, poner en un Dore la botella y guárdela en el frigorífico. (2) Solución B: Tome 30,0 g de acrilamida y 0,74 g de metinobisacrilamida, agregue agua para disolver y diluya a 100 ml, filtre, póngalo en una botella marrón y guárdelo en el refrigerador. (3) Tampón de electrodo (pH 8,3) Tome 6 g de trishidroximetilaminometano y 28,8 g de glicina, agregue agua para disolver y diluya a 1000 ml, guárdelo en el refrigerador y diluya 10 veces antes de usar. (4) Solución indicadora de azul de bromofenol: tomar 0,1 g de azul de bromofenol, añadir 3,0 ml de solución de hidróxido de sodio de 0,05 mol/l y 5 ml de etanol al 90 %, calentar hasta disolver y añadir etanol al 20 % para obtener 250 ml. (5) Solución de tinción: Tome 2,5 ml de solución de azul brillante de Coomassie G<[250]> al 0,25 % (p/v) y agregue una solución de ácido tricloroacético al 12,5 % (p/v) a 10 ml. (6) Solución de tinción diluida: tome 2 ml de la solución de tinción anterior y agregue una solución de ácido tricloroacético al 12,5% (p/v) a 10 ml. (7) Solución decolorante: solución de ácido acético al 7%.

3. Método de operación (1) Para hacer gel, tome 2 ml de solución A y 5,4 ml de solución B, agregue 2,9 g de urea para disolver, agregue 4 ml de agua, mezcle bien y bombee aire. elimine las burbujas en la solución, agregue 0,56%. Tome 2 ml de solución de persulfato de amonio y mezcle bien para hacer una solución de pegamento. Utilice inmediatamente una jeringa o un gotero delgado equipado con una aguja larga para agregar la solución de pegamento a lo largo de la pared del tubo en un recipiente pequeño. Tubo de vidrio (10 × 0,5 cm) con un tapón de goma en la parte inferior. Haga que la altura de la capa de pegamento alcance entre 6 y 7 cm, luego agregue lentamente una pequeña cantidad de agua para cubrir la superficie del pegamento. El tubo debe retirarse. Déjelo durante unos 30 minutos. Cuando aparezca una interfaz obvia, se completará la polimerización y se succionará la capa de agua. (2) La preparación de la solución estándar y la solución de prueba se realizará de acuerdo con las disposiciones de cada medicamento. (3) Electroforesis: coloque los tubos de vidrio de gel preparados en el tanque de electroforesis del disco. Agregue de 50 a 100 µl de solución de prueba o estándar a cada tubo para evitar la difusión, agregue de 1 a 2 gotas de glicerol o solución de sacarosa al 40%. gota de solución indicadora de azul de bromofenol al 0,04%, o agregue directamente unas gotas de solución indicadora de azul de bromofenol al 0,04% al tampón del tanque superior. La parte superior del tubo de vidrio se llena con el tampón del electrodo y el extremo superior está conectado al negativo. electrodo y el extremo inferior está conectado al electrodo positivo. Ajuste la corriente inicial a 1 mA para cada tubo. Después de unos minutos, aumente la corriente a 2 a 3 mA para cada tubo. Cuando el líquido indicador de azul de bromofenol se mueva a 1 cm del fondo del tubo de vidrio, apague la alimentación. . (4) Una vez completada la electroforesis de teñido y decoloración, use una jeringa equipada con una aguja larga y llena de agua para presionar el agua desde el fondo de la manguera a lo largo de la pared de la manguera. La tira se deslizará fuera del tubo. la tira en una solución de teñido diluida durante la noche o use Remojar en la solución de tinción durante 10 a 30 minutos, enjuagar con agua y luego usar una solución decolorante para decolorar hasta que el color de fondo del gel sin proteínas sea transparente. (5) Juicio de resultados Coloque la tira bajo una luz y obsérvela, y haga un juicio basado en la posición de la banda de color y la profundidad del color de la muestra de prueba y la muestra estándar. Movilidad relativa Las zonas electroforéticas de la muestra de prueba y del estándar a veces se pueden comparar con la movilidad relativa (R'<[m]>). La fórmula de cálculo es la siguiente: Movilidad relativa de la distancia desde el extremo de entrada del gel hasta la muestra de prueba o zona estándar (R'<[m]>)=——

La distancia desde el extremo de entrada del gel a la zona de azul de bromofenol Para el escaneo a distancia, coloque la tira transparente en un escáner de capa delgada de doble longitud de onda o en un escáner de electroforesis en gel para escanear e integrar, y calcular el contenido porcentual a partir del área del pico de cada componente.

5. Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS La electroforesis en gel de poliacrilamida SDS determina el peso molecular de las proteínas basándose en el hecho de que la mayoría de las proteínas pueden reaccionar con el tensioactivo catiónico dodecilsulfato de sodio (SDS). de modo que la carga negativa de las moléculas de proteína excede con creces la carga negativa de las moléculas de proteína naturales, eliminando el efecto de carga de diferentes moléculas de proteína, haciendo que la movilidad relativa de las moléculas de proteína (R'<[m]>) El tamaño dependa completamente depende del peso molecular, por lo que el peso molecular de la muestra de prueba se puede calcular a partir de la curva estándar del logaritmo y la movilidad relativa de la proteína estándar de peso molecular conocido.

1. Instrumentos y equipos: Igual que la electroforesis en gel de poliacrilamida a menos que se especifique lo contrario.

2. Reactivos (1) Solución líquida de acrilamida Pesar 22,2 g de acrilamida y 0,6 g de bisacrilamida, disolver en 100 ml de agua, conservar en una botella marrón y conservar a baja temperatura. (2) Para el tampón de gel, pese 8,82 g de dihidrógenofosfato de sodio (NaH2PO4·2H2O), 51,55 g de hidrogenofosfato de disodio (Na2HPO4·12H2O) y 2,0 g de laurilsulfato de sodio, y agregue agua hasta 1000 ml (si hay precipitación). ), se puede calentar a 37 ℃ para disolver). (3) Tampón de electroforesis Diluya el tampón de gel 1 veces. (4) Solución de tinción: Pesar 25 mg de Coomassie Brilliant Blue R<[250]> y disolverlos en 100 ml de una mezcla de 57% de etanol y 9,2% de ácido acético. (5) Solución decolorante: tomar 75 ml de etanol absoluto, añadir 50 ml de ácido acético glacial y diluir a 1000 ml con agua.

3. Método de operación Excepto por las siguientes disposiciones, todo lo demás es igual que la electroforesis en gel de poliacrilamida. (1) La preparación del gel se prepara con solución de acrilamida, tampón de gel, agua, solución de persulfato de amonio al 1,6 % y tetrametiletilendiamina (requiere enfriamiento) (10,1:15,0:3,4:1,5:0,045). (2) Preparación de la solución de proteína estándar y la solución de prueba: tomar la proteína estándar, agregar agua para preparar una solución que contenga de 2 a 5 mg por 1 ml y disolverla con el hidrolizado (21,6 g de urea y 0,04 g de dodecilsulfato de sodio). ). 40 ml de agua), mezclar 1:3 y colocar en el frigorífico durante la noche. La muestra de prueba se prepara según el método anterior.

(3) Electroforesis Ajuste la corriente a 8 mA por tubo.

4. Cálculo de la movilidad relativa y el peso molecular. Utilice calibradores o método de posicionamiento de escaneo para medir la distancia del movimiento del tinte, la longitud de la tira antes de teñir, la distancia del movimiento de las proteínas y la tira después de decolorar. longitud. Calcule la movilidad relativa de acuerdo con la siguiente fórmula: La distancia que se mueve la proteína La movilidad relativa de la longitud de la tira antes de la tinción (R'<[m]>)=————×———— La longitud de la tira después de decolorar. R'<[m]> es la abscisa, el logaritmo de la proteína estándar de peso molecular conocido es la ordenada, dibuje en papel de coordenadas semilogarítmicas y determine el peso molecular de la muestra de prueba a partir de la curva estándar.