¿Es eficaz aislar directamente los neutrófilos humanos para experimentos?
¿Aislamiento de neutrófilos de médula ósea de ratón?
Equipo experimental: Instrumentos (2 tijeras oftálmicas rectas pequeñas, 3 pinzas curvas pequeñas), gotero de plástico estéril, tubo de centrífuga de 15 ml, tubo EP de 4 ml , Placa de Petri, recipiente de 1 ml, malla de nailon de 70 um, reactivos de centrífuga de baja temperatura: PBS (1×, 10×), HBSS, percoll, solución de almacenamiento de percoll (percoll:10×PBS=9:1), solución de percoll (45%, 81%, 62%, 55%, 50%, diluir la solución madre de Percoll con 1xPBS a la concentración correspondiente respectivamente) Histopaque 1119, tampón de neutrófilos de ratón (MNB, ambos contienen 0,1% de albúmina sérica bovina, 1% de glucosa en solución HBSS )?
Materiales: ratones C57 de 8 a 12 semanas de edad Procedimientos experimentales:?
Los ratones fueron sacrificados tirando del cuello y se separó la tibia y el fémur. ¿Limpiar el fémur con una gasa y remojarlos en alcohol al 75% durante 5 minutos?
2. Utilice unas tijeras pequeñas y rectas para cortar ambos extremos de la médula ósea para exponer la cavidad medular, enjuague con MNB, 1 ml cada uno. tiempo, tibia Enjuague dos veces y fémur 3 veces. ?
3. Filtrar la solución de enjuague con una malla de nailon de 70 um, centrifugar para recoger las células, 600 g a 4 ℃ durante 10 min, baja velocidad. 4. ¿Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 3 ml de solución de percoll al 45%?
5. Preparación de gradiente de Percoll: 3 ml de 81%, 2 ml de 62%, 2 ml de 55%, 2 ml de 50% de percoll. solución 6. Coloque con cuidado la suspensión celular Centrífuga en gradiente de percoll, 1600 g, 30 min, 10 ℃, sin freno. 7. Deseche la solución por encima de la capa de percoll al 62 % y recoja la capa de percoll entre el 62 % y el 81 %. ?
8. Lavar dos veces con 10 ml de MNB, centrifugar a 600 g, 10 ℃, 10 min. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 3 ml de MNB. ?
9. Colocar con cuidado la suspensión celular en 3ml de Histopaque 1119, centrifugar a 1600g, 10°C, 30min sin frenar, y retirar la capa de glóbulos rojos. ?
10. Recoger la capa de células entre 1119 y MNB, lavar dos veces con 10 ml de MNB, 600 g, 4 ° C durante 10 min, centrifugar a baja velocidad 11. Resuspender las células en medio de cultivo hasta una cierta concentración. según sea necesario.