Oftalmología FBS
Instalaciones y equipamiento
Instalaciones: mesa ultralimpia, incubadora a temperatura constante, microscopio invertido, tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido, caja de secado con secador de pelo, congelador, balanza electrónica, baño María a temperatura constante , centrífuga , Esterilizador de vapor a presión.
Equipo:
1. Equipo de vidrio
Placas de Petri, frascos cuentagotas, pipetas graduadas, tubos de centrífuga, matraces de cultivo, vasos de precipitados, probetas graduadas y matraces Erlenmeyer.
En segundo lugar, equipos de plástico
Placas de petri porosas, placas de petri, botellas de cultivo
Tercero, equipos de caucho
Productos de caucho (preferiblemente silicona) productos) se utilizan como tapones y tapas para varios frascos o tubos de ensayo.
En cuarto lugar, equipos metálicos
Tijeras, pinzas, bisturíes, bisturís, pinzas vasculares, pinzas para tejidos, pinzas oftálmicas y varios tipos de agujas.
Verbo (abreviatura de verbo) otros artículos
Gasa, jeringa y aguja
Medio
Varios medios de cultivo celular de uso común Productos
1.BME (Águila Media Básica) Águila Básica Media.
⒉Memoria
⒊ DMEM
⒋ IMDM
⒌ RPMI-1640
⒍ M199
⒎·McCoy's 5A
⒏ F10 935438+02 ⒏ DMEM Mix F12 (3) Configure varios reactivos de cultivo celular comunes (tampón, solución salina equilibrada, etc.).
1, solución libre de calcio, magnesio y iones (1000 ml)
Cloruro de sodio (NaCl) 8 g de dihidrógeno fosfato de sodio, (NaH2PO4H20) 0,05 g, cloruro de potasio (KCl) 0,2 g, bicarbonato de sodio (NaHCO3) 1 g , citrato trisódico (Na3C6H5O7, H2O) 1g, glucosa 1g y agua desionizada o bidestilada hasta.
2.PBS (solución salina tamponada con fosfato) Tampón fosfato.
Solución A: 0,2mol/L de solución de hidrogenofosfato disódico, 28,4g de hidrogenofosfato disódico (anhidro) y 8,77g de cloruro sódico. Agregue agua desionizada o agua bidestilada hasta 1000 ml.
Solución B: solución de dihidrógenofosfato de sodio 0,2mol/L, 2,4g de dihidrógenofosfato de sodio (anhidro) y 8,77g de cloruro de sodio. Agregue agua desionizada o agua bidestilada hasta 1000 ml.
La solución A y la solución B se almacenaron a 4°C. Cuando los utilice, prepárelos a la concentración de pH requerida de acuerdo con la proporción que se muestra en la Tabla 3-2 y guárdelos a temperatura ambiente después del tratamiento en autoclave.
3. Solución de Hanks (solución salina equilibrada HBSS Hank)
(1) Método de preparación del licor madre A (20x)
①Colocar NaCl(A.R) 160g. , KCl (A.R) 8 g, mgso 4 · 7 h2o (A . R) 2 g y MgCl · 6 h2o (A . R) 2 g se disolvieron en 800 ml de agua bidestilada en secuencia. Después de disolver el primero, se añadió el segundo.
② Disolver 2,8g de CaCl_2 (A.R) en 100mL de agua bidestilada, y agitar continuamente durante la disolución (esta solución debe prepararse por separado y disolverse por separado).
Después de que el "soluto" de las dos soluciones anteriores se haya disuelto completamente, mezcle, complete hasta 1000 ml con agua bidestilada, agregue 2 ml de cloroformo como conservante y almacene a 4°C.
(2) Método de preparación del licor madre B (20×)
① Combinar na2hpo4.12h2o (a.r.) 3,04 g, kh2po4 (a.r.) 1,20 g y glucosa (A.R.) 20,0 g disueltos en 800 ml de agua bidestilada.
② Colocar solución de rojo de fenol al 0,4% y 0,4g de rojo de fenol en un mortero de vidrio, agregar 11,28mL de NaOH 0,01N hasta su completa disolución, transferir a un matraz aforado de 100mL, agregar agua hasta 100mL, filtrar, almacenar. a 7,4 y 4°C.
Después de que el "soluto" anterior se haya disuelto completamente, completar hasta 1000 ml con agua bidestilada, añadir 2 ml de cloroformo como conservante y conservar a 40 °C.
3) Utilice el método de combinación líquida (1×).
Tomar una parte de licor madre A y otra de licor madre B, añadir 18 partes de agua bidestilada, dividir en botellas, tapar las botellas y colgar la marca. Esterilizar a 115°C durante 25 minutos (para evitar daños a la glucosa), almacenar a temperatura ambiente de 4°C y puede usarse durante varios meses. Antes de usar, ajuste el pH deseado con bicarbonato de sodio al 7,5%.
4. Solución de Eagle (solución salina equilibrada de EBS Siegel)
La solución salina equilibrada puede mantener la actividad celular en un entorno de dióxido de carbono (CO2) durante un corto tiempo y puede utilizarse para las células. Limpieza antes de la disociación, transporte de células o tejidos, dilución durante el recuento celular, preparación de soluciones, etc.
5. Solución de Heps
El tampón biológico tiene propiedades químicas estables y una capacidad tampón más fuerte que el tampón de bicarbonato de sodio en el rango de pH de 7,2 a 7,6.
6. Solución tampón de bicarbonato de sodio
Es parte del sistema tampón convencional, pero es inestable y puede cambiar fácilmente el valor del pH debido al contenido de CO2 en el aire, afectando el efecto amortiguador.
Pasos específicos
1. ¿Restaurar [1]?
1. Saque el tubo de criopreservación del nitrógeno líquido, póngalo inmediatamente en un baño de agua a 37°C y agítelo suavemente (tenga cuidado de evitar que entre líquido en el tubo de criopreservación debido a las tapas flojas). . Después de que el líquido se derrita (aproximadamente 1 a 1,5 minutos), sácalo, rocía un poco de alcohol y colócalo en una mesa de trabajo limpia.
2. Vierta la suspensión celular en un tubo de centrífuga de 15 ml que contenga 10 ml de medio de cultivo (enjuague el tubo de criopreservación una vez con el medio de cultivo para eliminar todas las células adherentes) y centrifugue a 1000 °C durante 5 minutos. .
3. Verter el sobrenadante y añadir 1 ml de medio de cultivo para suspender las células. Aspire en una placa de cultivo de 10 cm que contenga 10 ml de medio de cultivo y agítela suavemente hacia adelante y hacia atrás para que las células en la placa de cultivo se distribuyan uniformemente.
4. Marcar el tipo de célula y la fecha, el nombre del cultivador, etc. y colocarlo en una incubadora con 5% de CO2 a 37°C. Cambie el medio de cultivo después de que las células se adhieran a la pared.
5. Dependiendo de la tasa de crecimiento celular, reemplace el medio de cultivo cada 2-3 días.
Segundo pase
1 Cuando la cobertura celular en la placa de cultivo alcance el 80%-90%, se debe realizar el pase.
2. Absorber el medio de cultivo original.
3. Añade una cantidad adecuada de tripsina (siempre que pueda cubrir las células) para la digestión durante 1-2 minutos.
4. Después de que las células se vuelvan redondas, agregue un volumen igual de medio que contenga suero para detener la digestión.
5. Utilice una pipeta para soplar las células hasta ponerlas en suspensión.
6. Aspirar las células en un tubo de centrífuga de 10ml o 15ml y centrifugar a 1000 rpm durante 5 minutos.
7. Verter el sobrenadante, añadir 1-2ml de medio de cultivo y hacer estallar todas las células.
8. Transferir las células a varias placas de cultivo según el tipo de célula. Generalmente hay 5 células cancerosas y 3 células normales. Continuar cultivando.
En tercer lugar, congelar y almacenar
Digerir las células y centrifugar (igual que arriba). Suspender las células en la solución de criopreservación preparada, distribuirlas en tubos de criopreservación esterilizados, dejarlas reposar unos minutos e indicar el tipo de célula y la fecha de criopreservación. 4 ℃ durante 30 min, -20 ℃ durante 30 min, -80 ℃ durante la noche y luego se almacenó y enjuagó en nitrógeno líquido.
Preparación de la solución de criopreservación: Se debe añadir lentamente 70% medio de cultivo completo + 20% FBS + 10% DMSO mientras se agita.