Lentivirus empaquetados virales
El vector lentivirus es un vector de terapia génica desarrollado en base al VIH-1 (virus de la inmunodeficiencia humana tipo I).
Características:
1. A diferencia de los vectores retrovirales generales, tiene la capacidad de infectar tanto células en división como células que no se dividen. A menudo se utiliza para infectar células que son difíciles de dividir. transfectar, como células de generación originales, células neuronales, células madre, células indiferenciadas, cardiomiocitos, células hepáticas, células endoteliales y células tumorales, con una eficiencia de casi el 100%.
2. cargarse hasta 5 kb
3. Después de que el gen objetivo ingresa a la célula huésped, se somete a una transcripción inversa y se integra en el genoma para formar material genético estable, lo que permite que el gen objetivo se exprese de manera estable y duradera. término en la celda.
4. Las partículas de vectores virales se utilizan para transfectar líneas celulares empaquetadoras a través de elementos empaquetadores y plásmidos que contienen genomas virales. El mecanismo de transcripción inversa se utiliza para construir un vector derivado del VIH-1 autoinactivante (SIV). Una vez transferido a la célula objetivo, pierde la capacidad de transcripción de la repetición terminal larga del virus, lo que reduce la posibilidad de producir virus recombinantes. y evitar la interacción con el virus. El problema de la interferencia del promotor.
5. El sistema de empaquetado de tercera generación actualmente ampliamente utilizado, el sistema de cuatro plásmidos, sólo contiene 3 de los 9 genes del VIH-1, a saber, gag, pol y rev. Dado que se ha eliminado el 60% de los componentes del genoma del VIH-1, el virus original no puede replicarse. Actualmente es el sistema de empaquetado de lentivirus con el coeficiente de recombinación más bajo y hasta ahora no se ha informado de ninguna recombinación. Sus ventajas técnicas más seguras, estables y eficientes están por delante de los sistemas de envasado de tres plásmidos y otros sistemas de envasado del mercado.
Las características anteriores determinan su aplicación e importancia:
1. El uso de vectores lentivirales para transportar el gen diana es más adecuado para construir cepas de transfección estables que la transfección transitoria con plásmidos.
2. El vector contiene elementos de secuencia que pueden empaquetarse, transfectarse e integrarse de manera estable de manera eficiente en el genoma de las células objetivo. El vector produce títulos más altos y proporciona soluciones rentables para experimentos con fluidos virales. que contiene el gen de interés.
3. Su alta eficiencia de transducción y su integración en el genoma proporcionan una vía favorable para la clonación de ARNi, ADNc y la investigación de genes informadores.
Como herramienta rápida y eficaz para entregar material genético, el lentivirus se ha vuelto muy popular en China y han surgido muchas empresas de servicios de envasado. Al mismo tiempo, cada vez más investigadores han superado su miedo a los virus y han optado por envasar sus propios productos. En comparación con los servicios de subcontratación y bricolaje (Do It Yourself), el coste de este último se reducirá considerablemente. Sólo necesitas comprar un kit de embalaje y construir un vector lentiviral para realizar experimentos. GeneCopoeia proporciona un kit de embalaje basado en un sistema de embalaje de tercera generación. El kit contiene todos los demás componentes excepto el vector básico lentiviral y las células empaquetadoras: mezcla de plásmido auxiliar de empaquetado, potenciador de títulos, reactivo de transfección específico de lentivirus (EndoFectin Lenti) y plásmido de control positivo eGFP.
Pasos y precauciones experimentales del envasado de lentivirus: Preparación del material: kit de envasado, plásmido viral, células (Nota: utilice el kit de envasado de acuerdo con las instrucciones. Verifique la concentración del plásmido viral para asegurar la DO( 260 nm/280 nm) está entre 1,8 y 2,0 y compruebe si el plásmido está intacto mediante electroforesis. Prepare las células antes de los experimentos de envasado para garantizar que las células estén en buenas condiciones). Prepare el complejo de reactivo de transfección/ADN: este paso es relativamente simple. , simplemente siga las instrucciones de funcionamiento del kit. Células herramienta de transfección: normalmente se utilizan células 293Ta y se añade el complejo ADN-Endofectina Lenti a la placa de cultivo que contiene las células empaquetadoras. Cultive durante la noche (8-14 horas) en un ambiente de CO2 a 37 °C. Recuerde reemplazar el medio de cultivo cada 6 horas. Agregue el potenciador de títulos TiterBoost para mejorar el título. Coseche el virus: recoja el medio de cultivo 48 horas después de la transfección y centrifugue a 500 * g durante 10 minutos para eliminar restos celulares e impurezas. Luego utilice una membrana de filtro de unión a proteínas de polietersulfona de 0,45 μm para eliminar impurezas como las proteínas. Coseche virus con mayor pureza. Verifique el título.