Capítulo 20: Cromatografía líquida de alto rendimiento
Comparado con la cromatografía de gases:
Según el estado de agregación de la fase estacionaria: cromatografía líquido-líquido y cromatografía líquido-sólido.
Según mecanismo de separación: distribución, adsorción, intercambio iónico y repulsión molecular.
Otros mecanismos de separación: cromatografía de afinidad, cromatografía quiral, cromatografía micelar, electrocromatografía y biocromatografía.
La fase estacionaria más utilizada en la actualidad es el enlace químico y la fase, denominada enlace químico y cromatografía.
Fase enlazada: fase estacionaria formada uniendo grupos orgánicos a la superficie del soporte. a través de una reacción química mutuamente.
NP normal, RP inversa
Se utilizan grupos ciano y amino como fase estacionaria, y disolventes no polares o débilmente polares como fase móvil.
Separación de compuestos moleculares polares a moderadamente polares
Generalmente, el mecanismo de separación es el particionamiento, pero también existen adsorciones, como los enlaces de hidrógeno.
Regla general: los componentes con formas farmacéuticas fuertes tienen un factor de capacidad K grande y luego salen. La polaridad de la fase móvil aumenta y se mejora la capacidad de elución.
Octadecilsilano, octilsilano, etc. , a veces con polaridad débil o media.
La fase móvil utiliza agua como disolvente básico y añade una cierta cantidad de regulador de polaridad.
El mecanismo de separación es controvertido y existen muchos modelos teóricos.
Principales factores que afectan el comportamiento de retención de componentes:
Separación de componentes no polares a moderadamente polares
La cromatografía de pares iónicos (IPC) se puede dividir en fase normal y Fase invertida, la fase normal rara vez se utiliza.
La cromatografía de pares iónicos de fase reversa (RP-IPC) añade un reactivo de par iónico a la fase móvil acuosa de modo que los iones del componente analizado y los contraiones del reactivo de par iónico generan iones sin carga en la fase móvil. Fase Iones neutros, componente K aumenta, utilizados para separar compuestos ionizables o iónicos.
Para análisis de alcaloides, catecolaminas, ácidos orgánicos, vitaminas y antibióticos.
Cromatografía iónica: Método que combina cromatografía de intercambio iónico y detectores de conductividad para analizar diversos iones.
Puede analizar productos de degradación de aniones orgánicos e inorgánicos, aminoácidos, azúcares, ADN y ARN.
Se puede dividir en tipo suprimido (tipo de doble columna) y tipo no suprimido (tipo de columna única)
Para iones X:
Usos del tipo de doble columna Dos columnas de intercambio iónico, una es una columna de separación llena de un intercambiador aniónico de baja capacidad de intercambio, la otra es un intercambiador de cationes limitado de alta capacidad de intercambio, los dos están conectados en serie. El componente
El tipo no suprimido puede utilizar una fase estacionaria con una menor capacidad de intercambio y una fase móvil con una concentración y conductividad muy bajas, de modo que la conductividad de fondo es baja y los iones de la muestra se pueden detectar directamente. por el detector de conductividad después de la elución.
Método cromatográfico para la separación y análisis de enantiómeros de compuestos quirales utilizando una fase estacionaria quiral (CSP) y un aditivo de fase móvil quiral (CMPA). También existen métodos indirectos (agregar reactivos quirales para convertir un par de enantiómeros en diastereómeros y separarlos mediante métodos convencionales).
La ciclodextrina (CD) es también un selector quiral. Su mecanismo de separación se debe principalmente a la acción del centro multiquiral de la aguja móvil y la cavidad inactiva de la molécula. Si los enantiómeros pueden empaquetarse firmemente en la cavidad e interactuar con los grupos de alcohol secundarios en el borde exterior de la molécula de CD, serán retenidos por la fase estacionaria y los dos enantiómeros se separarán debido a los diferentes grados de interacción con la CD. .
La cromatografía de afinidad (AC) es un método cromatográfico que utiliza o simula interacciones específicas entre biomoléculas para separar y analizar sustancias que pueden producir afinidad transferida a partir de muestras complejas. Máxima selectividad.
Requisitos: partículas pequeñas y uniformes, rápida transferencia de masa, alta resistencia mecánica, alta resistencia a la presión y buena estabilidad química.
Líquido-sólido: gel de sílice totalmente poroso, microesferas porosas de alto ángulo plano.
Los más utilizados son los enlaces y fases químicos.
Requisitos: buena estabilidad química; solubilidad adecuada; adecuado para detectores; alta pureza; baja viscosidad
Antes de usar, filtrar con una membrana microporosa para eliminar partículas sólidas y desgasificar.
Ecuación de separación:
Elija la concentración de disolvente adecuada para mantener el componente K dentro del rango óptimo, seleccione el tipo de disolvente adecuado, mejore la selectividad, aumente α y obtenga una buena resolución R > 1,5
En el enlace químico y la cromatografía, la capacidad de elución de un disolvente, es decir, la fuerza del disolvente, está directamente relacionada con su polaridad.
La polaridad del disolvente está representada por parámetros de polaridad del disolvente, que se utilizan para expresar las capacidades de elución en cromatografía de fase normal.
La fuerza del disolvente de la cromatografía en fase unida de fase inversa está representada por otro factor de fuerza s.
Los disolventes mezclados se pueden representar mediante la media ponderada de P o s.
Ecuación de la teoría de la velocidad de cromatografía líquida de alta resolución:
Minimizar el volumen muerto extracolumna.
(Imagen en la página 349)
La cromatografía líquida de alta resolución generalmente consta de un sistema de perfusión de alta presión, un sistema de muestreo, un sistema de separación en columna cromatográfica, un sistema de detección y una base de datos. sistema de procesamiento.
Clasificación:
Requisitos: alta sensibilidad, bajo ruido, amplio rango lineal, buena repetibilidad y amplio rango de aplicación.
Detector UV UVD: no destruye la muestra, sólo puede detectar sustancias con absorción UV y tiene restricciones en la fase móvil.
Detector de fluorescencia FD: tiene alta sensibilidad y sólo es adecuado para producir sustancias fluorescentes. Se suele utilizar para análisis de fármacos in vivo.
Detector electroquímico ECD: método polarográfico, método culombimétrico, método amperométrico, método conductimétrico. La conductividad se usa para la detección de iones, el amperaje se usa ampliamente y tiene alta sensibilidad. Adecuado para el análisis de componentes traza, se puede detectar cualquier cosa con actividad redox.
Detector de dispersión de luz evaporativa ELSD: adecuado para componentes con menor volatilidad que la fase móvil, utilizado para azúcares, ácidos grasos superiores, fosfolípidos, vitaminas, aminoácidos, triacilgliceroles y esteroides para diversas sustancias. La reacción es casi; lo mismo; pero la sensibilidad es baja, la fase móvil debe ser volátil y no puede contener sales tampón.
Automatización de instrumentos:
Recopilación y análisis de datos cromatográficos:
Sistema de control por ordenador central:
Cromatografía líquida de ultra rendimiento UPLC: con La teoría y los principios de la cromatografía líquida de alto rendimiento, que utilizan una fase estacionaria de partículas pequeñas, un volumen de sistema extremadamente bajo y métodos de detección rápidos, mejoran en gran medida la separación, la velocidad de análisis, la sensibilidad de detección y la capacidad máxima cromatográfica, mejorando así de manera integral la separación de la cromatografía líquida. Eficiencia analítica .
Comparación de condiciones operativas (Tabla 355)
Ventajas: velocidad de análisis rápida; alta eficiencia de separación; alta sensibilidad: tecnología de partículas pequeñas y diseño de instrumentos integrados
Van Según la ecuación, se puede encontrar que cuanto menor es el tamaño de partícula de la fase estacionaria, mayor es la separación. Al mismo tiempo, cuanto menor sea el tamaño de partícula, mayor será la velocidad lineal óptima de la fase móvil y más amplio será el rango de optimización. Por lo tanto, reducir el tamaño de partícula puede aumentar la velocidad del análisis. Sin embargo, aumentará la diferencia de presión de la columna del sistema, que está limitada por la resistencia mecánica de la fase estacionaria y la resistencia a la presión del sistema de cromatografía.
El método estándar externo y el método estándar interno se usan comúnmente, y el método de normalización rara vez se usa. El método de autocontrol de componentes principales es un método común para determinar el contenido de impurezas en los medicamentos.
El método de control de componentes principales se puede dividir en dos tipos: sin factor de corrección y con factor de corrección;
Preste atención a la aplicabilidad del sistema cromatográfico Prueba de rendimiento: número de placas teóricas, resolución, factor de cola, repetibilidad.