¿Qué materiales se utilizan para el diagnóstico molecular clínico y qué precauciones se deben tomar al recolectarlos?
Estandarización del diagnóstico molecular en laboratorios clínicos
Autor: Anónimo Fuente del artículo: Visitas a Internet: 132 Hora de actualización: 2009-8-10
Reimpreso
p>
Estandarización del diagnóstico molecular en laboratorios clínicos
Centro de Laboratorio Clínico Li Jinming del Ministerio de Salud 100730
Antes de la extracción de ácido nucleico, apropiado y efectivo Se requiere un tratamiento previo de las muestras. Es fundamental garantizar el éxito de las pruebas posteriores de extracción y amplificación de ácidos nucleicos. Además, en el diagnóstico molecular clínico, se debe establecer un procedimiento estandarizado de preparación y procesamiento de muestras clínicas. Esto también es un indicador importante para la estandarización de los métodos de purificación de ácidos nucleicos para la extracción de ácidos nucleicos, la eficiencia de la extracción y la capacidad de eliminar eficazmente los inhibidores de la PCR.
3. Estandarización de reactivos y métodos de detección
Para formar un modelo de reactivo y método que pueda usarse para el diagnóstico molecular clínico, existen muchas opciones, como la PCR debido a su extremada eficacia. alta sensibilidad de detección, es fácil causar resultados falsos positivos debido a la contaminación cruzada entre muestras o productos de amplificación anteriores. Además, la presencia de inhibidores de la PCR en la muestra, las diferencias de temperatura entre los pocillos del instrumento de amplificación, la concentración inadecuada de reactivos y la falta de extracción de ácidos nucleicos de la muestra pueden conducir fácilmente a resultados falsos negativos. Por lo tanto, los fabricantes de reactivos deben considerar cuidadosamente los factores anteriores y adoptar el método de detección más ideal al desarrollar los reactivos de diagnóstico molecular clínico correspondientes. Por ejemplo, los reactivos de PCR deben comenzar desde la perspectiva de cómo evitar eficazmente resultados falsos positivos y falsos negativos. En el kit, se utiliza dUTP para reemplazar dTTP en los cuatro dNTP y se agrega uridina glicosilasa (UNG) para elaborar el producto amplificado. Aparecen ADN que no se encuentran en el ADN natural. En la amplificación de nueva detección, si hay contaminación de productos de amplificación anteriores, pueden degradarse bajo la acción de UNG. Esto puede evitar hasta cierto punto falsos positivos causados por la contaminación previa del producto de amplificación. Otro ejemplo es agregar estándares internos competitivos o no competitivos a los reactivos, que pueden monitorear eficazmente los errores en la extracción, amplificación y análisis de productos de ácidos nucleicos, evitando así resultados falsos negativos.
4. Estandarización del análisis de los resultados de las pruebas [9-11]
Los métodos de diagnóstico molecular de laboratorio clínico se pueden dividir en dos categorías: cualitativos y cuantitativos según la forma en que expresan los resultados de las pruebas. . La medición cualitativa a menudo expresa los resultados de la medición en términos de "sí" o "no", es decir, "positivo" o "negativo". Los resultados de la determinación cuantitativa se expresan en términos de concentración (como UI/L, UI/ml, μg/L, número de copias/ml, etc.). La base para determinar los resultados de la medición cualitativa es el establecimiento del valor de juicio positivo (límite). El establecimiento del valor de corte debe evitar la aparición de resultados falsos positivos o falsos negativos en la medida de lo posible. La base para la determinación cuantitativa es la curva dosis-respuesta (es decir, la curva estándar) medida utilizando una serie de estándares de concentración o la cantidad de estándar interno.
El valor de corte se establece en la medición cualitativa para evitar resultados falsos positivos o falsos negativos tanto como sea posible, pero los resultados de la medición dentro de un cierto rango del valor de corte tienen cierta incertidumbre, lo cual es Generalmente se llama "área gris". En las pruebas clínicas reales, los técnicos de laboratorio a menudo se sienten confundidos sobre cómo determinar el tamaño de la "zona gris" y cómo informar los resultados de las muestras clínicas dentro de la "zona gris". Por lo tanto, estandarizar los procedimientos no sólo permite a los técnicos de laboratorio tener reglas a seguir al informar los resultados, sino que también puede reducir o evitar efectivamente la emisión de resultados erróneos.
El procesamiento de datos de medición cuantitativa a menudo utiliza diferentes modelos matemáticos, que no solo pueden mejorar la precisión del dibujo de curvas estándar, sino también obtener resultados más precisos con menos datos y cálculos, y ahorrar tiempo. Hoy en día, las microcomputadoras se han popularizado rápidamente en los laboratorios clínicos y han surgido en una corriente interminable varios programas de procesamiento de datos de medición, lo que hace que la expresión de los resultados de las mediciones cuantitativas sea más precisa y efectiva. Por ejemplo: el establecimiento de umbrales para la PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real y el rango permitido de cambios en la pendiente, la intersección y el coeficiente de correlación de la curva estándar están claramente especificados en sus procedimientos operativos estándar para el procesamiento de datos y la notificación de resultados.
En PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real (la mayoría de las cuales son actualmente de este tipo) con la ordenada como el valor Ct (el número de ciclos de amplificación cuando la curva de amplificación del ácido nucleico objetivo específico cruza la línea umbral) y la abscisa como la copia inicial número, la pendiente A = -, donde E es la eficiencia de amplificación intercepta B = log YCt, donde YCt es la cantidad de producto de amplificación cuando se alcanza el número de ciclos de amplificación cuando la curva de amplificación de un ácido nucleico objetivo específico cruza la línea umbral; . Por lo tanto, la pendiente A está relacionada con la eficiencia de amplificación de una PCR de fluorescencia en tiempo real específica. Cuando la eficiencia de amplificación es 100, que es 1, A es -3,32. método, su pendiente debe ser ≤ -3,32 Cuanto mayor sea el valor, mayor será la pendiente. La intersección B es el valor Ct de la muestra negativa cuando la plantilla original se acerca a 0. Por lo tanto, para una PCR de fluorescencia en tiempo real, si el número de ciclos de amplificación se establece en 40, su intersección B debe ser ≥ 40.
Lo ideal es que el informe de procesamiento de datos de medición cumpla con los siguientes requisitos: (1) Fácil de entender. Haga que los resultados informados sean comprensibles incluso para quienes no están familiarizados con el ensayo. (2) Los resultados de la medición cualitativa son claros. Es decir, reacción o no reacción, positiva o negativa, dentro del rango normal o anormal, etc. (3) La medición cuantitativa debe tener un cierto rango lineal. (4) Los datos obtenidos después del procesamiento deben ser repetibles. (5) La evaluación de la prueba no debe basarse en la distribución normal supuesta. (6) Debe haber una explicación adecuada y razonable.
5. Aplicación de materiales de referencia y materiales de control de calidad [2, 12-26]
Los materiales de referencia son el núcleo de la estandarización del diagnóstico molecular clínico, es decir, un componente determinado. de pruebas clínicas No importa qué método se utilice para medir el valor de un marcador específico en una muestra, se pueden obtener resultados similares utilizando un material de referencia unificado. El valor se puede rastrear hasta el mismo estándar, haciéndolo comparable.
Los materiales de referencia se pueden clasificar en tres niveles: primero, segundo y tercero. La cantidad de materiales primarios de referencia es limitada y se pueden utilizar durante 10 a 20 años. Son productos liofilizados. El estándar primario se puede utilizar para calibrar los estándares secundario y terciario. Por ejemplo, sustancias de calibración utilizadas en mediciones de rutina. Los estándares internacionales pueden servir como materiales de referencia primarios y los estándares secundarios pueden usarse para mantener la calibración una vez que se hayan determinado los estándares primarios. Los estándares secundarios calibrados están disponibles a nivel nacional. La concentración de analitos específicos en los materiales estándar internacionales actualmente disponibles se expresa generalmente en UI/L, pero también se puede expresar en mol/L y g/L. Este último suele ser una sustancia con una estructura molecular clara.
El valor del calibrador utilizado en la medición clínica es trazable al valor del estándar primario. Generalmente consta de los siguientes pasos de calibración, a saber, sustancia estándar y método de medición, tampón y su matriz, control de. dilución, evaluación estadística de resultados finales y control de calidad, etc. Al establecer un método de medición, el valor del material estándar primario se puede transferir al estándar secundario, terciario y/o calibrador a través del proceso anterior, de modo que el valor medido del método establecido se pueda rastrear hasta el material estándar primario. Este proceso de transferencia debe repetirse cuando se introduce un nuevo lote de reactivos para mantener la confiabilidad de la calibración.
El método de determinación del material de referencia puede utilizar la determinación multicéntrica del método decisivo, el método de referencia y el procedimiento de determinación. Un método decisivo es un método de referencia con alta precisión y sin sesgos sistemáticos. Cuando no se dispone de un método concluyente, se puede determinar un método de referencia. El método de referencia tiene mayor variación que el método decisivo. En las pruebas de proteínas, ácidos nucleicos y genes, actualmente existen pocos métodos de referencia a nivel internacional, la determinación de valores estándar suele seguir ciertos procedimientos y utiliza un modelo de determinación conjunta por parte de múltiples laboratorios de referencia. Los resultados se expresan en UI/L. Generalmente basándose en ciertos métodos estadísticos, el contenido más bajo que pueden detectar la mayoría de los laboratorios se establece en 1 UI/L.
Las sustancias de control de calidad son sustancias bien caracterizadas en cantidades conocidas y en la misma matriz que las muestras reales. Esta sustancia suele mezclarse con otras impurezas. Según su uso, se puede dividir en tres categorías: productos de control de calidad en interiores, muestras de evaluación de calidad entre habitaciones y bandejas de suero de control de calidad. Los materiales de control de calidad interior se utilizan para el control de calidad interior en el trabajo diario en los laboratorios clínicos, y sus valores establecidos deben ser trazables a estándares secundarios.
Las muestras de evaluación de calidad entre laboratorios son preparadas o supervisadas por la organización a cargo de la evaluación de calidad entre laboratorios y, por lo general, no requieren una determinación precisa de los valores. Sin embargo, para la determinación cualitativa, es necesario utilizar varios métodos existentes para aclarar los resultados negativos y negativos. valores positivos. La placa de suero de control de calidad es la muestra de suero original con resultados claros negativos y positivos obtenidos mediante el examen. La intensidad positiva varía y la muestra negativa puede contener sustancias que causarán interferencias no específicas en la determinación. Los sueros negativos y positivos suelen ser 1: 1. La placa de suero se puede utilizar para evaluar la calidad de kits de inmunoensayo cualitativos específicos. El contenido de la evaluación incluye especificidad, sensibilidad, tasa de cumplimiento y capacidad antagónica a posibles sustancias que interfieren no específicas.
Actualmente existen muchos materiales de referencia internacional de primer nivel que pueden utilizarse para el diagnóstico molecular clínico, como proteínas séricas, inmunoglobulinas, citocinas, hormonas y algunos marcadores tumorales [alfafetoproteína (AFP), antígeno prostático específico (PSA), antígeno carcinoembrionario (CEA), gonadotropina coriónica humana (hCG), etc.], ácidos nucleicos virales (VHA, VHB, VHC, VIH-1, VPH B19, etc.) y antígenos y anticuerpos patógenos. (HBsAg, anti-HBs), etc. Estos materiales de referencia son proporcionados por algunas organizaciones e instituciones de estandarización internacionales, como el Instituto Nacional Británico de Estándares Biológicos y Controles de Calidad (NIBSC), los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de EE. UU. y el Comité Nacional del Colegio de Americanos. Patólogos (CAP). Institutos Nacionales de Salud (NIH), etc. A nivel nacional, el Instituto de China para el Control de Productos Farmacéuticos y Biológicos y el Centro de Laboratorios Clínicos del Ministerio de Salud proporcionan algunos materiales de referencia nacionales correspondientes.
6. La relación entre los procedimientos de trabajo, los métodos de reactivos, los materiales de referencia y la comparabilidad de los resultados de laboratorio.
Como se puede observar en la Figura 1, entre los diversos elementos de la estandarización del diagnóstico molecular clínico. , los materiales de referencia son un requisito previo para obtener resultados comparables. Pero los materiales estándar por sí solos no son suficientes. La estandarización de los métodos de reactivos y los procedimientos de trabajo también es un elemento indispensable. Como núcleo, los materiales de referencia se pueden utilizar como “estándar de oro” para evaluar si los métodos de reactivos y los procedimientos de trabajo han alcanzado la estandarización.
Los fabricantes de reactivos utilizan materiales estándar para medir muchos ácidos nucleicos, genes, proteínas y otras macromoléculas que carecen de métodos de referencia, haciendo que su cuantificación sea trazable, asegurando así el uso de reactivos diferentes o iguales a nivel de reactivo. son comparables entre laboratorios clínicos. El uso de materiales de referencia en laboratorios clínicos no solo puede evaluar eficazmente la precisión de la medición de los métodos reactivos antes de su uso, sino también evaluar completamente la efectividad de todos los procedimientos de trabajo establecidos por el laboratorio para garantizar resultados precisos de las pruebas.
Figura 1. La relación entre varios elementos de la estandarización de la tecnología de diagnóstico molecular del laboratorio clínico
En resumen, la estandarización es el requisito previo para lograr la comparabilidad de los resultados del diagnóstico molecular del laboratorio clínico, y la estandarización es no es un solo factor, sino que consta de muchos vínculos clave, cuyo núcleo es el desarrollo y la aplicación de materiales estándar. Como todos sabemos, un sistema de referencia consta de tres aspectos: métodos de referencia, materiales de referencia y laboratorios de referencia. Sin embargo, es imposible que los laboratorios clínicos utilicen universalmente métodos de referencia en su trabajo diario, ni que se conviertan en laboratorios de referencia. Los únicos que pueden aplicarse universalmente son los materiales estándar. Las funciones de los materiales de referencia son: en primer lugar, los fabricantes de reactivos utilizan materiales de referencia para garantizar la trazabilidad de los resultados de sus pruebas de reactivos al preparar los kits de pruebas; en segundo lugar, el personal del laboratorio clínico utiliza materiales de referencia para verificar los métodos de los reactivos y trabajar en el trabajo real. el programa. Éstas son la única manera de garantizar la exactitud de los resultados de las pruebas diarias y también son el requisito previo para el reconocimiento mutuo condicional de los resultados entre diferentes laboratorios.