Métodos y principios para detectar glucógeno hepático en cortes de parafina
La tinción con ácido periódico-Schiffs (PAS) es un método histoquímico clásico para detectar glucógeno. Este método utiliza ácido periódico para oxidar los grupos hidroxilo de dos carbonos adyacentes de azúcares en grupos aldehído, y luego el reactivo de Schiff (magenta incoloro) reacciona con los grupos aldehído para producir sustancias rojas o violetas. La profundidad del rojo refleja los tejidos y las células. Contenido de glucógeno (Referencia: Comparación de los efectos de tinción de dos métodos de corte para detectar glucógeno). Este método se utiliza a menudo para visualizar glucógeno y otros polisacáridos. La solución colorante no sólo puede mostrar glucógeno, sino también sustancias mucosas neutras y algunas sustancias ácidas, así como cartílago, glándula pituitaria, moho, hongos, pigmentos, sustancias amiloides, membrana basal, etc. (ref: /Goods-4761.html ).
El periodato (también conocido como periodato) es un agente oxidante fuerte que puede oxidar el grupo 1,2-diol en azúcares y sustancias relacionadas en dialdehídos, aldehídos y El reactivo de leucina se puede combinar para formar un compuesto magenta. produciendo un color rojo púrpura. Debido a que el ácido periódico también puede oxidar otras sustancias en las células, es un paso crítico seleccionar la concentración de ácido periódico y el tiempo de oxidación para que el grupo etilenglicol se oxide en un grupo aldehído sin sobreoxidarse (ref: /goods- 4761.html).
? La tecnología PAS es el único método para detectar diferentes tipos de mucinas (como glucógeno, mucina y glicoproteína), pero la tecnología PAS no puede distinguir entre mucina y glucógeno. Para identificar con precisión los materiales mocosos (como la mucina y el glucógeno), es necesario agregar un paso de digestión del glucógeno. En la mayoría de los casos, se puede utilizar alfa-amilasa o malta amilasa para catalizar la hidrólisis de enlaces glicosídicos. Se forma el disacárido maltosa soluble en agua y se elimina el glucógeno de las secciones de tejido antes de aplicar la técnica PAS. La saliva humana se considera un medio eficaz para digerir el glucógeno, pero no se recomienda su uso debido a su seguridad y a la falta de saliva estandarizada (ref: /goods-4761.html).
La característica de la solución de tinción de glucógeno D-PAS es que el glucógeno se trata con amilasa antes de la tinción con PAS. Se requieren dos secciones idénticas para la digestión del glucógeno. Después de la desparafinización, una pieza se trató con un tampón apropiado que contenía amilasa y la otra pieza se trató sólo con tampón. Luego se tiñeron ambas secciones con el método PAS, y la desaparición de la tinción después de la digestión indicó la presencia de glucógeno (ref: /goods-4761.html).
Pasos experimentales:
Grupo de control:
Secciones de parafina, desparafinadas al 50% de etanol, lavadas brevemente con agua, solución salival de amilasa añadida gota a gota, cultivadas a 37 °C Incubar durante 30 minutos.
Grupo experimental:
Durante la digestión del grupo control, se prepararon cortes en parafina, se desparafinaron en etanol al 50%, se lavaron con agua, se oxidaron con ácido peryódico al 0,5% durante 7 min, Se enjuagó con agua corriente durante 5 minutos y luego se sumergió en agua destilada dos veces.
Saca el magenta incoloro del frigorífico, vuelve a ponerlo a temperatura ambiente y tiñe en la oscuridad durante 15-20 minutos.
Enjuaga dos veces con metabisulfito de sodio 0,5, 65438 ± 0 minutos; cada vez, dejar correr agua durante 5 minutos, lavar con agua destilada (dependiendo de la situación) y luego teñir con hematoxilina de Hari o hematoxilina de Meyer durante 2 minutos. Enjuagar con agua del grifo, diferenciar con etanol de ácido clorhídrico 0,1 durante 1 minuto, enjuagar con agua tibia hasta que se vuelva azul, enjuagar con agua corriente, secar en una incubadora a 42°C durante 24 horas, sellar con pegamento neutro y tomar fotografías;
Análisis de densidad óptica (software de análisis de imágenes Image-Pro Plus), detecta la densidad óptica acumulada y el área de la parte PAS positiva en la sección y calcula la densidad óptica promedio;
Análisis de datos: análisis de varianza;;
Predicción del resultado de la tinción: después de la tinción con PAS, las partículas de glucógeno son rojas o moradas, y las secciones de parafina muestran una estructura clara del tejido hepático, pero hay muchas vacuolas y pérdida de glucógeno en el hígado. células.
Nota: 1.
La elección del fijador es crucial para la conservación in situ del glucógeno, que se puede fijar a 4 °C para reducir la pérdida; las secciones de parafina de 2,3 um son más adecuadas para este experimento. 3. Una vez preparado el magenta, es necesario hacerlo; almacenado en la oscuridad a 4 ° C; 4. No calificado magenta 0,5 g / 100 ml de metabisulfito de sodio puede restaurar la capacidad de teñido 5. El tiempo de digestión de la amilasa salival debe controlarse estrictamente. Si es demasiado corto, no puede controlarse por completo. descompone el glucógeno y, si tarda demasiado, afectará la estructura del tejido. 6. El glucógeno se disuelve en agua y se corta. No debe entrar en contacto con el agua antes de que el ácido peryódico lo oxide, de lo contrario se perderá el glucógeno. grandes cantidades.
Preparación y configuración de reactivos:
Fijador de Carnoy: 60 ml de alcohol puro, 10 ml de ácido acético glacial, 30 ml de cloroformo o alcohol al 75%.
Método de preparación del vino ácido peryódico de noche: ácido peryódico (hio 4·2H2O) 0,4g alcohol 95 m 35ml/5ml acetato sódico (2,72g agua destilada 100ml), 5ml agua destilada 10ml. Ponlo en una botella marrón y guárdalo en el frigorífico durante dos semanas.
Solución Schiff:? Agregue 0,5 g de fucsina básica a 100 ml de agua destilada y agite el matraz ocasionalmente durante 5 minutos para que se disuelva por completo. Enfriar a 50°C, filtrar y agregar 10 ml de ácido clorhídrico 1 N, enfriar a 25°C, agregar 0,5-1 g de metabisulfito de sodio, dejar reposar a temperatura ambiente durante al menos 24 horas, luego sellar y almacenar en el refrigerador.
Configuración líquida del alcohol de Schiff: 11,5ml de vino de Schiff, 1,5ml de ácido clorhídrico, 23ml de alcohol puro.
Solución de sulfito: 10ml de metabisulfito sódico, 10ml de ácido clorhídrico 1N, 180ml de agua destilada.
Hematoxilina de Harry o Meyer.