La diferencia entre las mediciones de fluorescencia en estado estacionario y la fluorescencia resuelta en el tiempo

La tecnología de fluorescencia resuelta en el tiempo tiene dos métodos de medición basados ​​en el dominio del tiempo y el dominio de la frecuencia. Dado que los paquetes de datos resueltos en el tiempo contienen más información que los datos de fluorescencia en estado estacionario, la tecnología de fluorescencia resuelta en el tiempo se ha convertido en una de las principales herramientas de investigación en bioquímica y biofísica en los últimos años. La tecnología de imágenes de fluorescencia durante toda la vida puede obtener simultáneamente información sobre el estado molecular y la distribución espacial, y se ha utilizado ampliamente en biología y medicina. A continuación se presentará brevemente la tecnología de medición de la fluorescencia resuelta en el tiempo y de la vida útil de la fluorescencia en términos de principios, instrumentos y aplicaciones.

1. Principios básicos de la fluorescencia y la vida útil de la fluorescencia.

El principio y el proceso de desactivación molecular después de la absorción de luz se pueden representar intuitivamente mediante el diagrama de Perrin2Jablonsky (la Figura 1 es una representación simplificada). En resumen, los electrones en el nivel de energía del electrón del estado fundamental singlete S0 en la molécula absorben fotones de una determinada longitud de onda de acuerdo con la regla de Frank2Condon y se excitan a uno de los niveles de energía del electrón del estado excitado singlete (generalmente el estado S1). nivel, este proceso dura aproximadamente 10-15 s; después de un breve proceso de relajación vibratoria (aproximadamente 10-12-10-10 s), una gran cantidad de electrones se reunirán en el estado de energía vibratoria más bajo de S1. Hay varias formas para que los electrones en este estado liberen energía y regresen al estado fundamental S0. Estas modalidades, incluida la relajación vibratoria, se conocen colectivamente como proceso de desactivación. Si el proceso de liberación de energía va acompañado de la liberación de fotones, se denomina inactivación radiativa; si la energía se libera sólo por colisión y no se liberan fotones, se denomina inactivación no radiativa.

La emisión de fluorescencia es un proceso común de inactivación de la radiación, que generalmente se refiere al proceso en el que los electrones pasan del estado S1 al estado S0 y simultáneamente emiten fotones. El tiempo de este proceso suele ser de 10-10 ~ 10-7s. Al utilizar instrumentos ópticos para detectar cambios en la intensidad de la emisión de fluorescencia a lo largo del tiempo, se puede obtener información sobre la vida útil de la fluorescencia del sistema.

Existen varias formas de desactivación sin radiación: la conversión interna se refiere al proceso de transición electrónica entre estados de energía electrónica de la misma multiplicidad, generalmente entre 10-11 y 10-9s; conversión entre sistemas (crossover); se refiere al proceso de transición de electrones entre diferentes estados de energía, como la transición del estado singlete S1 al estado triplete T1, que generalmente toma de 10-10 ~ 10-8 s. La extinción de la fluorescencia se refiere al proceso de transición de electrones a través de la interacción intermolecular y la energía; conversión. El proceso de liberación de energía de moléculas excitadas también se llama conversión externa. Estos procesos de inactivación no radiativa desempeñan un papel muy importante a la hora de determinar la vida útil de la fluorescencia del sistema.

Además, después de que el electrón pasa al estado T1, existe una cierta probabilidad de pasar al estado S0 emitiendo fotones, lo que se denomina emisión de fosforescencia. O vuelve a saltar al estado S1 y emite un fotón de regreso al estado S0, lo que se llama fluorescencia retardada. Debido a limitaciones de espacio, estos dos tipos de luminiscencia no se analizan aquí.

2. Curva de disminución de la fluorescencia y vida útil de la fluorescencia.

Bajo la iluminación de la fuente de luz de excitación, el sistema de fluorescencia emite fluorescencia en todas las direcciones cuando la fuente de luz deja de emitir luz, la fluorescencia; no desaparecerá inmediatamente, sino que irá decayendo gradualmente hasta llegar a cero. Con base en los principios anteriores, la atenuación de la fluorescencia del sistema ideal se puede derivar matemáticamente de manera rigurosa.

Para una solución diluida de sustancia fluorescente A, suponiendo que su concentración es [A] (mol·L-1), suponiendo que el entorno de todas las moléculas de A es similar, entonces la ruta de decadencia de la fluorescencia de todas las A moléculas en la solución iguales. Hay un pulso de luz muy corto. Su ancho temporal puede considerarse cero si su duración es insignificante en comparación con las constantes de velocidad involucradas en el proceso. Esta fuente de luz lineal ideal se llama pulso delta2. Cuando la solución es excitada por un pulso δ2, debido al corto tiempo de absorción de luz y relajación de la vibración, se puede considerar que un cierto número de moléculas de A absorben fotones en el tiempo 0 para alcanzar el estado excitado S1, y la concentración está representada por [1A3]. Estas moléculas en el estado excitado volverán al estado fundamental S0 mediante radiación (aquí fluorescencia) o sin radiación, y sus constantes de velocidad están representadas por kSr y kSnr respectivamente.

Este proceso se puede comparar con una reacción de primer orden. La tasa de desintegración de las moléculas excitadas se puede expresar mediante la fórmula (1):

-d[1 a3]dt =(kSr kSnr)[1 a3]. (1)

Al integrar la fórmula (1), podemos obtener la relación entre la concentración de moléculas excitadas en el tiempo t y la concentración excitada inicial [1A3]0:

[1 a3]=[1 a3]0 exp-tτS(2)

El τS en la fórmula se denomina vida útil S1 del estado excitado, que se expresa mediante la fórmula (3):

τS=1kSr kSnr(3)

La intensidad de fluorescencia IF es proporcional a la concentración de moléculas excitadas y la constante de velocidad de desactivación de la radiación de fluorescencia:

IF(t)= kSr [1 a3]= kSr[1 a3]0 exp-tτS(4)

Cuando se mide con un instrumento de fluorescencia, la intensidad de fluorescencia IF observada también está relacionada con los parámetros del instrumento. Por lo tanto, la relación entre la intensidad de la fluorescencia y la vida útil del estado excitado se puede expresar simplemente como:

I(t)=αexp-tτ(5) fórmula (5)

Los resultados muestran que , En un solo sistema que utiliza el pulso δ2 como fuente de luz de excitación, la intensidad de la fluorescencia decae exponencialmente. La vida útil de la fluorescencia τ observada es equivalente a la vida útil τS del estado S1. No solo se ve afectada por la emisividad de la fluorescencia, sino también por varios procesos no radiativos. Por lo tanto, la vida útil de la fluorescencia aparente medida directamente también se denomina vida útil natural.

Para un sistema complejo, debido a las diferentes propiedades o microambientes de cada sustancia fluorescente, la curva de desintegración de la fluorescencia 2 de todo el sistema es la suma de múltiples funciones de desintegración exponencial, lo que se denomina desintegración multiexponencial:

I(t)=∑iαiexp-tτi(6)

La curva de caída de fluorescencia anterior se obtiene basándose en que la fuente de luz de excitación es una fuente de luz lineal ideal de pulso δ2 (Figura 2 ).

De hecho, cualquier fuente de luz real tiene un cierto ancho, por lo que en aplicaciones prácticas, la expresión anterior debe modificarse aún más. Si la intensidad de la fuente de luz de excitación se expresa en función del tiempo E(t), la señal de detección R(t) se puede expresar como la convolución entre E(t) y δ2 respuesta al impulso I(t):

R(t)=E(t)? I(t)=∫t0E(t′)I(t-t′)dt′(7)

Basándonos en las conclusiones extraídas de la teoría anterior, podemos diseñar un instrumento de detección de vida útil de fluorescencia, analizar la medición resultados, y además Obtener información cinética del sistema.