Encontrar precisamente la aguja en el pajar: tema de detección CRISPR
Dado que Addgene es demasiado largo, decidimos presentarlo en al menos dos partes.
Edición anterior: Guía CRISPR de Addgene (1)
Referencia: Guía CRISPR
Dado que esta parte ya no se trata simplemente de leer la guía CRISPR, hay Además, el trabajo de consultar información y leer literatura ya no se llama Guía CRISPR.
Una noche, cuando mi hermana menor y yo estábamos describiendo el experimento de detección CRISPR en WeChat, ella exclamó y dijo: “Hermana mayor, ¿no es esto una aguja precisa en un pajar?” Por lo tanto, el título de nuestro artículo en este número utiliza una descripción muy reveladora de la hermana menor. En tiempos normales, solo podemos estudiar la función de un determinado gen mediante la eliminación/eliminación individual y la sobreexpresión. Sin embargo, el cribado CRISPR nos permite realizar decenas de miles de operaciones de este tipo al mismo tiempo y completar la edición de genes de todo el genoma de una sola vez. tiempo Se puede decir que: Encuentra la aguja en el pajar con precisión.
El alto rendimiento es la configuración estándar de la biotecnología en la nueva era, desde la PCR (RNA-seq) que puede completar más de 50.000 genes a la vez hasta el seguimiento del linaje celular (código de barras), sin afectar la precisión. En tales circunstancias, el tiempo y el costo de la investigación científica se reducen considerablemente. Según nuestra introducción anterior, el sgRNA dirige la proteína Cas9 a la secuencia objetivo, y Cas9 se une al ADN y luego corta el ADN. Las siguientes situaciones son muy fáciles de entender:
(1) Cas9 + 1. Un sgRNA: edite un gen;
(2) Cas9 + 2 sgRNA: edite dos genes o elimine un fragmento de ADN grande entre dos sgRNA
(3) Cas9 + múltiple; sgRNA: puede editar múltiples genes al mismo tiempo;
(4) Cas9 + decenas de miles de sgRNA: edita decenas de miles de genes al mismo tiempo.
Para las situaciones 3 y 4, la colección de múltiples sgRNA se denomina biblioteca CRISPR, y el tamaño de la biblioteca puede variar desde docenas de sgRNA hasta cientos de miles de sgRNA. La aparición de bibliotecas nos permite editar decenas de miles de genes al mismo tiempo y luego seleccionar conjuntos de genes que tienen un efecto significativo en un fenotipo específico para guiar el siguiente paso de la investigación. Este proceso se llama cribado CRISPR. es el siguiente:
Como se puede ver en la imagen de arriba, la biblioteca CRISPR es un conjunto que contiene sgRNA (A-C), que se transfiere a células de tipo salvaje o que expresan Cas9 de forma estable (D) mediante transducción lentiviral. y el grupo de sgRNA se infecta después de que las células se distinguen por características específicas (resistencia a medicamentos, etc.), se utiliza la secuenciación NGS para identificar conjuntos de genes relacionados con las características específicas. Además de la visualización de procesos convencionales, también debemos tener en cuenta que la carga de trabajo de construir una biblioteca colectiva es bastante grande. Por ejemplo, la biblioteca GeCKO v2 del grupo del profesor Zhang Feng puede apuntar a 19.050 genes codificadores para mejorar la eficiencia de la edición. , cada gen está diseñado Hay al menos 6 sgRNA, por lo que la biblioteca completa contiene 123,411 sgRNA. Cada sgRNA necesita construir un plásmido correspondiente. La construcción de toda la biblioteca es costosa, pero solo necesitamos comprarla en Addgene por $ 500. Puedes usar estas herramientas. Realmente quiero agradecer a estos gigantes.
Los tipos de biblioteca CRISPR también se clasifican según el propósito experimental, la especie, el tamaño de la biblioteca y el método de entrega. Se puede ver información específica en la página web de Addgene:
Cosas en las que pensar antes. diseño de experimentos de detección CRISPR Los siguientes problemas:
(1) La detección CRISPR necesita utilizar electroporación para amplificar la biblioteca en la etapa de preparación, y se requiere secuenciación NGS para determinar la abundancia de la biblioteca, aunque ya existen algunas bibliotecas. que puede utilizar células químicamente competentes, pero asegúrese de verificarlo cuidadosamente antes de elegir la biblioteca;
(2) Los experimentos de detección CRISPR requieren una gran cantidad de células, por lo que para algunas células que no se pueden amplificar, son limitados en número y muy valiosos, como células primarias, etc., la detección CRISPR puede no ser aplicable;
(3) La mayoría de las bibliotecas CRISPR requieren el uso de lentivirus para administrar ARNg/Cas9 a las células objetivo. .
Por lo tanto, los usuarios deben considerar completamente si las condiciones del grupo de investigación pueden cumplir con los requisitos anteriores. Una vez que se determina que las condiciones experimentales son adecuadas, el siguiente paso es seleccionar una biblioteca. Al seleccionar una biblioteca, también debe considerar los siguientes puntos:
(1) Tipo de modificación genética: knockout. , activación o inhibición del gen diana;
(2) Número de ARNg: la biblioteca CRISPR puede apuntar a todo el genoma o a un tipo específico de gen, como el recientemente reportado TCR knockin pool en la biblioteca CRISPR que se utiliza. para mejorar la actividad de las células T CRT en tumores sólidos 36 genes diana.
(3) Especie: Los gRNA de una biblioteca CRISPR específica son exclusivos del genoma de un organismo específico, y la biblioteca solo es compatible con células de ese organismo.
(4) Esqueleto de biblioteca: si ya hay Cas9 en el esqueleto, puede usarlo directamente; si no lo hay, debe usar el plásmido Cas9 o requerir que las propias células expresen Cas9; .
La mayoría de las bibliotecas CRISPR requieren el uso de sistemas de administración lentivirales. Generalmente, existen varios andamios: LentiCRISPR y lentiGuide-Puro (como se muestra a continuación). un sistema plasmídico; este último requiere el uso de un plásmido Cas9.
Cada biblioteca CRISPR es diferente; sin embargo, la mayoría de las bibliotecas CRISPR tienen varias características únicas: en primer lugar, cada biblioteca de genes generalmente contiene de 3 a 6 ARNg para garantizar que cada objetivo tenga efecto de edición genética, por lo que las bibliotecas CRISPR contienen miles de ARNg únicos. el diseño de ARNg dirigido a múltiples genes de las bibliotecas CRISPR generalmente se optimiza para seleccionar ARNg con alto contenido en el objetivo y bajo contenido fuera del objetivo; las bibliotecas knockout generalmente se dirigen a exones expresados constitutivamente 5', mientras que las bibliotecas de activación y represión se dirigen a regiones promotoras o potenciadoras.
Aunque las bibliotecas lentivirales que contienen Cas9 son actualmente los métodos de detección CRISPR más populares, no son adecuados para todos los tipos de células o experimentos. Las bibliotecas CRISPR de mamíferos de cadenas principales de AAV se utilizan principalmente para experimentos in vivo, y las bibliotecas en forma retroviral se pueden utilizar en células con poca eficiencia de transducción lentiviral. Además, debido a problemas técnicos, CRISPR rara vez se utiliza en bacterias, pero todavía existen varias bibliotecas CRISPR bacterianas que logran efectos inhibidores a través de dCas9.
En el artículo TSC1 y DEPDC5 regulan la latencia del VIH-1 a través de la vía de señalización mTOR, para explorar los genes clave que regulan la latencia del virus del VIH, el autor construyó por primera vez células indicadoras fluorescentes del VIH (VIH-1 proviral DNA+ GFP), cuando el virus VIH se replica, GFP también se expresa al mismo tiempo, por lo que la actividad del virus VIH se puede observar a través de la fluorescencia verde.
En las células indicadoras de VIH-GFP, se transfirió la biblioteca de sgRNA para realizar una desactivación genética a gran escala. Después de un cierto período de tiempo, se utilizó FACS para clasificar las células que expresaban una fuerte fluorescencia verde. Después de 4 ciclos, se utilizó FACS para clasificar las células que expresaban una fuerte fluorescencia verde. Se obtuvo fluorescencia (VIH latente) y alta fluorescencia (actividad del VIH) en dos grupos de células, y se encontró la abundancia de sgRNA en los dos grupos de células mediante secuenciación NGS. Después de tres repeticiones, se encontró que 257 genes tenían un efecto positivo. Actividad del virus VIH. Finalmente, a través de los datos, analiza y selecciona el conjunto de genes TOP. En el futuro, se podrá realizar una verificación específica del conjunto de genes TOP.
A través de este ejemplo, también podemos imaginarnos reemplazar las células GFP con células tumorales resistentes a los medicamentos, como erlotinib, y cambiar la clasificación de FACS en dos grupos de dosificación + sin dosificación después de un cierto período de tiempo, al detectar. En la diferencia en la abundancia de sgRNA entre los dos grupos de células, se pueden encontrar genes relacionados con la resistencia a erlotinib.
(1) Debe prestar atención a si el promotor en el marco es adecuado para sus células objetivo. Por ejemplo, el promotor CMV tiene un espectro muy amplio, pero su eficiencia para las células madre embrionarias humanas sí lo es. muy bajo. Es necesario elegir un promotor con esqueleto EF1α.
(2) Algunas bibliotecas requieren que las propias células expresen Cas9, lo cual es comprensible. Sin embargo, algunas células son muy frágiles cuando expresan Cas9 en un nivel alto. En este momento, es necesario considerar el uso de una. Sistema Cas9 inducible, y la construcción de este sistema es un experimento difícil en sí mismo, por lo que se debe realizar un análisis exhaustivo por adelantado antes de diseñar.
(3) La amplificación de la biblioteca requiere una carga de trabajo muy grande y debe realizarse lo más estrictamente posible de acuerdo con el protocolo y estar equipada con un kit de superextracción de plásmidos. Algunas bibliotecas requieren el uso de personal competente especial. células, y estas células no se importan del extranjero. Se venden en el exterior y son muy caras.
(4) Dado que la biblioteca es muy grande y el recubrimiento de lentivirus se realiza en grandes cantidades, costará mucho usar Lipo3000 o los reactivos de transfección de Roche. En este momento, puede considerar usar PEI40000 y otros baratos. y reactivos de transfección eficaces. Buen reactivo de transfección.
(5) Además, el recubrimiento de lentivirus requiere la selección de células 293T con buen estado y bajo número de pases. Si hay células 293FT, el efecto será mejor.
(6) Considere el conflicto de marcadores de selección. Por ejemplo, si las células diana expresan Cas9 de manera estable mediante transfección lentiviral y el marcador de selección es puromicina, entonces casi todos los genes de selección de resistencia en la biblioteca son puromicina. , esto es un conflicto.
Aún nos falta descubrir detalles más concretos.