Método de detección de saxitoxina
Los métodos de detección biológica incluyen: (1) Método de prueba de toxicidad biológica. El bioensayo en ratones es el método estándar para detectar toxinas paralizantes de los mariscos promovido por la AOAC y es el único método reconocido internacionalmente. Este método tiene bastante éxito en detectar la toxicidad total de una muestra, pero no caracteriza con precisión las toxinas individuales de la muestra. Además, se realizan análisis biológicos de moscas domésticas y langostas. Los principios de las tres técnicas bioanalíticas anteriores son similares. (2) Prueba de citotoxicidad. La saxitoxina tiene las propiedades de un bloqueador de los canales de Na y puede antagonizar los efectos de la muscarina y la veratrina, reduciendo o "rescatando" los cambios en la morfología celular y la lisis y muerte celular. El antagonismo o efecto de "rescate" es proporcional a la cantidad de toxina. correspondiente. A partir de esta correspondencia se puede calcular el contenido de toxinas. El método establecido al principio era utilizar un microscopio para contar el número de células viables para detectar la cantidad de toxina PSP, pero la prueba llevó mucho tiempo, la operación fue complicada y se requirió una gran cantidad de células. Con base en este principio, se desarrolló y utilizó con éxito el dispositivo de diagnóstico rápido STX MIST para determinar la toxicidad total de PSP y la toxicidad relacionada de STX, neoSTX, GTX y dcSTX. El dispositivo es muy sensible, detecta rápidamente y no requiere equipo de cultivo de tejidos ni experiencia. (3) Tecnología de inmunoensayo. Con la adquisición de anticuerpos anti-STX, se han desarrollado gradualmente técnicas de inmunoensayo como la reacción de hemaglutinación, el radioinmunoensayo y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. Entre ellos, el ELISA de competencia directa es el método más utilizado, con un límite de detección de hasta 3 pg/. ml y ELISA indirecto. El límite de detección también puede alcanzar 10 pg/ml. El método inmunológico es sensible, conveniente y rápido, pero la clave es obtener anticuerpos. La reactividad cruzada de cada toxina es baja y no puede reflejar completamente la fuente del veneno en la muestra. (4) Análisis de receptores. Es decir, el método de análisis de unión al receptor en fase sólida se basa en las características de las toxinas PSP que pueden unirse a las proteínas del canal de Na. Detecta la cantidad de toxinas PSP mediante el marcaje de isótopos, que es rápido, confiable y preciso. Llewellyn et al. reemplazaron la proteína del canal de Na con saxifilina similar a la transferrina, que se une específicamente a STX y es específica para la identificación de STX, distinguiéndola así de la identificación de TTX.
Los métodos de medición instrumental incluyen (1) el método HPLC y su tecnología con guiones. La cromatografía líquida de alto rendimiento tiene alta sensibilidad, gran especificidad, límite de detección bajo y tiempo de análisis corto. Puede proporcionar más información sobre toxinas y es el método principal para la detección de toxinas. El cromóforo de la molécula de saxitoxina en sí es muy débil y difícil de detectar, por lo que debe oxidarse hasta convertirse en un cromóforo fluorescente antes de la detección y detectarse con un detector de fluorescencia. Los métodos de oxidación incluyen principalmente oxidación previa a la columna y oxidación posterior a la columna. La oxidación posterior a la columna se realiza en una columna adicional después de la columna de separación, lo que simplifica los pasos de la operación. Con el desarrollo de la tecnología de espectrometría de masas, la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) se ha convertido en un medio poderoso para la identificación de sustancias. (2) Cromatografía en capa fina. El método TLC es uno de los métodos tradicionales para detectar toxinas PSP y rara vez se utiliza. Sin embargo, la aparición de nuevos equipos de detección ofrece un nuevo espacio para su desarrollo. Separé STX y sus congéneres mediante cromatografía de capa fina con varilla en una columna cromatográfica y los detecté con un detector termoiónico de llama (FTID). Como resultado, el límite de detección de STX fue de 5 ng y los límites de detección de otros congéneres también alcanzaron el nivel de ng. Además, la cromatografía de gases, la cromatografía en columna de intercambio iónico y la electroforesis son técnicas tradicionales para detectar toxinas STX, con diferentes ventajas y desventajas. El bioensayo en ratón (MBA) es un método de detección desarrollado antes de que se identificara STX, y otros métodos de detección se basan en este método. MBA se ha utilizado para detectar STX durante mucho tiempo y es un método de detección legal confirmado por la AOAC en 1958. La mayoría de los países todavía utilizan este método. Este método es técnicamente sencillo y factible y no requiere equipo especial.
La respuesta de las células nerviosas de rata al STX es la misma que la de las células nerviosas humanas, por lo que los resultados de la medición de este método están directamente relacionados con la evaluación de riesgos para la salud humana. La mayoría de los países estipulan que el contenido máximo aceptable de STX en productos de mariscos marinos es de 80 μg STXeq/100 g; México lo controla en 30 μg STXeq/100 g y Filipinas lo controla en 40 μg STXeq/100 g. Sin embargo, algunas personas creen que el límite de detección de 80 μg STXeq/100 g puede garantizar que la salud humana no se vea amenazada. Los niveles de estas toxinas en el agua potable también varían. En 1999, los investigadores calcularon experimentalmente que el contenido máximo aceptable de PST en el agua potable era de 3 μg STXeq/L. Posteriormente, Australia adoptó esta concentración en las normas para el agua potable, Brasil la convirtió en una norma legal obligatoria y Nueva Zelanda adoptó esta concentración como el nivel máximo aceptable en el agua potable. MBA no es lo suficientemente sensible a esta concentración y es difícil detectar muestras sin concentración. El límite de detección más bajo de MBA es 40 μg STXeq/100 g, lo que equivale a 0,2 μg/mL de STX o 200 μg/L de STX. Por lo tanto, aunque el MBA se ha utilizado ampliamente para detectar el contenido de STX en mariscos después de la bioconcentración, no es adecuado para detectar el contenido de STX en agua potable, ni puede caracterizar con precisión una sola toxina en una muestra, y los métodos experimentales de detección en animales son insuficientes en algunos casos. áreas han sido deshabilitadas. En respuesta a estos problemas, se han desarrollado gradualmente algunos métodos nuevos para detectar la intoxicación por mariscos, como la química, la bioquímica, la determinación de la toxicidad, etc., que también se pueden utilizar para la detección de cianobacterias de agua dulce y fuentes de agua contaminadas.
Se estableció un bioensayo celular para detectar el contenido de PST, que puede reemplazar al MBA en las pruebas de toxicidad. Este método está diseñado específicamente para detectar toxinas como STX, que bloquean los canales de Na dependientes de voltaje. El análisis de células de neuroma detecta PST a nivel de los canales de sodio en las células nerviosas. STX es un bloqueador de los canales de Na y su función puede comprobarse mediante el antagonismo con la veratrina, que abre los canales de sodio. Primero, se estableció un bioensayo celular para evaluar los resultados utilizando la morfología del neuroblastoma de ratón como criterio de valoración. Posteriormente, Jellet y Manger mejoraron el método y utilizaron un método colorimétrico para mostrar una mejor selectividad. Por lo tanto, si los laboratorios pueden afrontar los costos de instrumentación de los métodos de detección basados en MS, es probable que este método de detección reemplace el análisis cromatográfico de STX en el futuro. La actividad celular se mide mediante puntos finales, lo que facilita el control automático. En este método, las células de neuroma se cultivaron en placas de cultivo celular de 96 pocillos y se trataron con el activador del canal de Na veratrina para mejorar la entrada de Na y el inhibidor de Na/K-ATPasa ubenina, bloqueando así la salida de Na. La viabilidad celular se determinó utilizando MTT (3-[4,5-difenil-2hidroxi]-2,5-difeniltetrazol) en presencia de PST. Utilizando las cantidades estándar de veratrina y ubenina, el grado de protección celular se puede comparar con la cantidad estándar de PST, cuantificando así la cantidad total de PST y luego convirtiendo los resultados en equivalentes de STX. En este ensayo se pueden utilizar células de neuroblastoma tanto de ratón como de humano.
La saxifilina es una proteína con una estructura similar a la transferrina. Las investigaciones muestran que tiene una alta afinidad por las PST. Sin embargo, diferentes saxifilinas tienen diferentes afinidades por diferentes análogos. Hasta la fecha, el saxífrageno aislado de ciempiés tropicales ha mostrado la menor selectividad en los experimentos. Aprovechando esta característica, Llewellyn LE et al. establecieron un método de receptor específico para detectar PST. El límite de detección de este método es de 6,3 μg STXeq/L, es decir, 1,3 μg STXeq/100 g de marisco. Sin embargo, los investigadores dicen que si se aumenta el tamaño de la muestra sin interferencia adicional de la matriz, el límite de detección de este método disminuirá. El proceso de extracción de petrosina cruda de ciempiés tropicales es muy simple y el producto preparado es muy estable, puede congelarse y descongelarse repetidamente y almacenarse a -80°C durante más de un año. Se han completado la clonación del gen y la construcción de la biblioteca que codifica la proteína saxifilina. La proteína se puede expresar en un sistema de expresión eucariótico y el producto de expresión obtenido tiene actividad biológica.
Estudios adicionales han demostrado que es factible utilizar ensayos de receptores SCBA y de saxifilina para detectar la actividad de los canales de sodio no PST en ostrácodos y mariscos, porque los no PST como la tetrodotoxina (TTX) no se unen a la saxifilina y la detección Los resultados se correlacionaron bien con los de HPLC y MBA.
Este método se utilizó originalmente para monitorear toxinas marinas en mariscos y productos pesqueros y ha sido bien validado para la detección de neurotoxinas marinas. Otros investigadores también han utilizado este método para detectar derivados de PST dominantes en cianobacterias de agua dulce, validando aún más este método. Los resultados muestran que los resultados del bioensayo de neurocitoma son muy similares a los resultados del bioensayo en ratón (coeficiente de correlación R2 = 0,96) y tienen la ventaja de una alta sensibilidad, con un límite de detección de 10 ng STXeq/mL de extracto (equivalente a 2,0 μg STXeq/100 g mariscos). Los resultados obtenidos mediante bioensayos celulares también se correlacionan bien con los obtenidos mediante métodos cromatográficos. Sin embargo, el bioensayo tiene la ventaja única de que tiene buena sensibilidad a cualquier toxina que inhiba los canales de Na, ya sea un análogo conocido de las PST o una variante desconocida. Este método puede detectar muchas toxinas no identificadas e indetectables mediante cromatografía, como lo describen Humpage et al. Los bioensayos celulares no pueden diferenciar entre toxinas similares y solo pueden proporcionar un valor de efecto acumulativo para todas las toxinas, por lo que, a diferencia de MBA, es difícil determinar la respuesta tóxica de análogos de toxinas relacionados en ensayos de cultivos celulares a menos que cada análogo se analice individualmente. Sin embargo, Llewellyn et al. presentaron datos que muestran que los bioensayos celulares predicen mejor la toxicidad que los MBA cuando se utilizan mezclas complejas de PST. Llewellyn et al. también analizaron 21 extractos de mariscos que contenían PST complejada utilizando MBA, ensayos de cultivo celular, HPLC y ensayos de radiorreceptores. De las cuatro técnicas de detección, los resultados de los ensayos de cultivos celulares relacionados con MBA fueron los más cercanos a la toxicidad esperada. Sin embargo, los bioensayos celulares todavía tienen algunos inconvenientes. En primer lugar, dado que este método se basa en el antagonismo de la veratrina y la ubenina, es necesario utilizar concentraciones adecuadas para hacerlo sensible a las PST. Como lo discutieron Jellet et al., cualquier cambio en la concentración de toxina reducirá la sensibilidad del método para la detección de PST. En segundo lugar, el dispositivo de detección estándar de este método funciona lentamente y requiere un tiempo de incubación celular prolongado (24-48 h) para desarrollar un efecto citotóxico en las células de neuroblastoma. La cromatografía líquida de alta resolución se utiliza ampliamente en la separación de compuestos orgánicos y también es el primer método de análisis instrumental para la detección de PST. Sin embargo, esta tecnología también tiene algunas deficiencias, como la necesidad de estándares de toxinas como referencia, la falta de enzimas fotorreactivas o portadores de derivatización post-columna para preparar productos fluorescentes, especialmente la posibilidad de transformación química de las PST durante el proceso de preparación de muestras. Esta transformación a menudo convierte toxinas poco tóxicas en toxinas altamente tóxicas, lo que hace imposible determinar la verdadera toxicidad de la toxina en la muestra original. Por lo tanto, la variación de las toxinas ha impulsado el desarrollo de métodos de detección y métodos de extracción y aislamiento más precisos. Bates y Rapoport propusieron el primer método de detección física y química de STX. Debido a la falta de un portador cromogénico para STX, este método solo puede lograr el propósito de detección utilizando peróxido de hidrógeno para oxidar STX en compuestos fluorescentes en un ambiente alcalino. En ese momento, se pensaba que el método era más sensible que el bioensayo en ratones y se recomendaba para pruebas de rutina de muestras de mariscos. Sin embargo, este método es muy complejo y utiliza varios disolventes y más de 10 procesos químicos. Mejoraron el método, aumentando la precisión y la reproducibilidad, pero el método sigue siendo muy complejo de utilizar.
En la década de 1980, muchas instituciones de investigación descubrieron nuevos compuestos utilizando métodos como la difracción de rayos X, la cromatografía de capa fina-detección de fluorescencia y la cromatografía líquida de alta velocidad (HSLC). En 1975, Shimizu et al. describieron por primera vez la existencia de gTX1, GTX2 y gTX3. Separe STX de gTX usando una columna de gel de poliacrilamida Sephadex G o bio-gel P-2 y luego use HSLC para resolver el pico de gTX en tres toxinas diferentes.
En 1987, Oshima y sus colaboradores desarrollaron un método de oxidación posterior a la columna que puede proporcionar un análisis detallado de las PST contenidas en extractos de dinoflagelados naturales, floraciones de algas, mejillones, ostras, etc. En contraste con el método de oxidación posterior a la columna de Oshima, Lawrence et al desarrollaron un método de cromatografía líquida que utiliza oxidación previa a la columna para generar derivados de PST fluorescentes. Demostraron que la oxidación del peróxido de hidrógeno es más sensible para el análisis de toxinas no hidroxiladas, mientras que la oxidación del periodato es más sensible para el análisis de toxinas hidroxiladas. Durante este tiempo, mejoraron la técnica, como agregar formiato de amonio al oxidante periodato, lo que mejoró el análisis de neoSTX, GTX1, B2 y C3. La adición de este compuesto a la fase móvil mejoró el análisis de neoSTX y B2. mejor. Dado que el valor del pH tiene una gran influencia en los resultados de la prueba, los investigadores controlaron el valor del pH durante la prueba. Cuando Gago-Martínez utilizó el método de precolumna, los valores de pH de los procesos de oxidación de peryodato y peróxido se ajustaron a 7,2-12 y 8,2-12,8, respectivamente, y los rendimientos finales de productos de oxidación fluorescentes fueron diferentes. El rendimiento de neoSTX mediante oxidación de peryodato alcanza un máximo a pH 8,2, mientras que los rendimientos de STX, GTX2/3, dcSTX y gTX5 también alcanzan un máximo a pH 10-11,5. Lawrence et al. afirmaron que el pH se puede controlar fácilmente mediante la oxidación previa a la columna y, por lo tanto, los resultados son más reproducibles porque los cambios de pH durante la oxidación posterior a la columna son pequeños y tienen poco impacto en el rendimiento de los productos marcados con fluorescencia. Sin embargo, a pesar de la relativa simplicidad del método de precolumna, algunas PST forman el mismo producto de oxidación, mientras que otras forman más de un producto fluorescente. Este método se recomienda como método de selección para el seguimiento de proyectos. El plan original era utilizar primero la oxidación con ácido periódico. Cuando se detectan la mayoría de PST y la concentración de toxina excede el límite de detección convencional de 80 μg STXeq/100 g, se utiliza la oxidación con peróxido de hidrógeno. La oxidación cromatográfica se ha utilizado para detectar toxinas de mariscos y estudiar la distribución de PST en diferentes regiones del cerebro de rata. Creían que este método era muy adecuado y muy sensible, por lo que se determinó que era uno de los métodos de detección oficiales de PST en los países europeos. Sin embargo, Ben-Gigirey et al. realizaron estudios de laboratorio y concluyeron que aunque este método es adecuado para estudios de detección, los resultados obtenidos al analizar muestras que contienen toxinas más complejas no son ideales y no son efectivos para todas las PST. Además, este método solo se dirige a análogos de toxinas como STX, GTX2/3, dcSTX, dcGTX2/3, etc., y puede obtener resultados de detección satisfactorios. Turner et al. utilizaron este estándar para validar aún más el método de Lawrence, incluida su selectividad, linealidad, límite de detección, precisión, recuperación, exactitud, repetibilidad y aplicabilidad, y agregaron PST como dcNeoSTX y dcGTX2/3. Turner et al. mejoraron este método, aumentaron la estabilidad del producto de oxidación y mejoraron la pureza del intercambio iónico en fase sólida. Finalmente, concluyeron que este método puede obtener resultados satisfactorios.
La cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) es una tecnología de detección eficaz que se puede utilizar para identificar compuestos desconocidos, cuantificar sustancias conocidas, dilucidar las propiedades químicas y la estructura de nuevas moléculas y lograr una alta sensibilidad. alta selectividad, cuantificación precisa y paso alto. Sin embargo, LC-MS es costoso y requiere técnicos profesionales para su operación y mantenimiento. No obstante, Quilliam recomienda la detección por LC-MS como método común para detectar toxinas marinas. Uno de los desafíos de la detección de PST mediante espectrometría de masas es que los reactivos de apareamiento iónico pueden interferir con la ionización de los compuestos objetivo, por lo que los reactivos de apareamiento iónico deben tener una cromatografía de fase inversa eficiente para las PST. Por ello, Jaime et al. desarrollaron un método cromatográfico basado en elución emparejada no iónica y oxidación electroquímica poscolumna, utilizando columnas de intercambio aniónico y catiónico en serie. Dell'Aversano et al. desarrollaron una cromatografía líquida hidrófila práctica que no solo puede separar las PST principales, sino también las toxinas de formaldehído, toxinas columnares, etc. de las cianobacterias. Con este método, se detectaron 15 PST y se identificaron nuevos análogos de toxinas mientras se ejecutaba un programa de monitoreo de reacción selectiva en el espectrómetro de masas.
Diener y sus colaboradores utilizaron cromatografía de interacción hidrófila zwitteriónica combinada con espectrometría de masas y detección de fluorescencia para detectar PST en un solo gradiente, respectivamente. Llegaron a la conclusión de que ambos métodos pueden obtener resultados cuantitativos confiables y pueden aislar bien las PST más relevantes. Los límites de detección de estos dos métodos son sólo ligeramente diferentes. La sensibilidad de los detectores de fluorescencia es mejor, mientras que los detectores de MS tienen tiempos de ejecución más cortos, como el ensayo de unión al receptor (RBA), las técnicas de análisis inmunológico, etc. Con el desarrollo de la ciencia y la tecnología, se han aplicado algunos nuevos métodos de investigación para la detección de STX y sus análogos, como métodos de biosensores, cromatografía-espectrometría de masas, PCR cuantitativa de fluorescencia, etc. Debido a que ELISA tiene las ventajas de sensibilidad, velocidad y operación simple, se ha utilizado ampliamente en el campo de las pruebas, especialmente en los campos de las pruebas médicas y alimentarias. El desafío de esta técnica es mantener su capacidad para identificar la diversidad estructural de sustancias objetivo ignorando los efectos de otros compuestos en matrices complejas al detectar mezclas de compuestos relacionados (como las PST). En este sentido, Usleber et al. resumieron los avances de la investigación en el establecimiento de una tecnología de detección de anticuerpos. Los estudios han demostrado que los anticuerpos anti-STX tienen una reacción cruzada débil con neoSTX y esta selectividad se puede aplicar a todos los análogos de esta familia. Chu et al encontraron una correlación débil entre la detección basada en anticuerpos anti-STX y la detección basada en anticuerpos anti-neoSTX. Combinando los resultados de las dos pruebas, aunque la tasa de detección ha mejorado, todavía no es alta. Es solo 80-85 para MBA y los resultados positivos son menores. Kawatsu et al. establecieron anticuerpos monoclonales contra gTX2/3 para mejorar los anticuerpos previamente establecidos contra STX y neoSTX. Este anticuerpo se diferencia de otros anticuerpos de la familia STX/neoSTX pero tiene una afinidad similar por gTX2/3, dcGTX2/3 y C1/2. Garthwaite et al. realizaron un estudio en profundidad de múltiples métodos de detección y recomendaron el uso de un conjunto completo de ELISA que puede detectar no solo PST en muestras de mariscos, sino también toxinas amnésicas de mariscos, toxinas diarreicas de mariscos y toxinas neurotóxicas de mariscos. . PCR cuantitativa por fluorescencia Al-Tebrineh J et al. establecieron un método de PCR cuantitativa SYBRgreen especial para la detección cuantitativa de STX producida por cianobacterias Anabaena. Este método infiere principalmente la toxicidad de la muestra midiendo el número de copias de la secuencia de poliacetilo única en el grupo de genes STX identificado en las cianobacterias. Al-Tebrineh J et al. utilizaron este método para detectar muestras de agua recolectadas de lagos, embalses y ríos en diferentes regiones de Australia, y determinaron el enriquecimiento de STX en el agua y la densidad celular de cianobacterias mediante HPLC y microcitometría. Los experimentos confirmaron que el enriquecimiento de STX está efectivamente relacionado con el número de copias del gen STX, lo que significa que este último puede usarse como medida del potencial tóxico de Anabaena y otras cianobacterias. Los genes STX cuantitativos dirigidos a PCR también se pueden utilizar para monitorear la capacidad de producción de STX de Anabaena y varias otras cianobacterias y para estudios ecofisiológicos.