Aplicación de la tecnología de hibridación fluorescente in situ

Esta tecnología se puede utilizar no sólo para la localización cromosómica de genes o secuencias conocidas, sino también para clonar genes o marcadores genéticos y estudiar aberraciones cromosómicas. Tiene ventajas en la investigación sobre caracterización, cuantificación, integración y expresión de genes. En los exámenes citogenéticos, las sondas de secuencia repetitiva se utilizan con mayor frecuencia. Son sondas de ADN satélite alfa, ADN satélite beta y sondas de ADN satélite clásicas. La sonda de ADN satélite alfa detecta principalmente el centrómero de los cromosomas humanos. El ADN satélite beta se encuentra alrededor de los cromosomas acrocéntricos y la heterocromatina del cromosoma 1. El ADN saiellita clásico tiene repeticiones cortas de AATGG ubicadas en la heterocromatina de los cromosomas 1, 9, 15, 16 y alrededor del brazo largo del cromosoma Y. Las dos últimas sondas no sólo pueden comprobar el número de cromosomas, sino también detectar cambios sutiles en las partes mencionadas anteriormente. Las señales fluorescentes generadas por las tres sondas se encuentran todas en centrómeros o puntos de unión, por lo que a menudo se utilizan para la identificación. Las células del líquido amniótico pueden examinarse directamente mediante FISH sin cultivo y se encuentran en la trisomía 21 (síndrome de Down), la trisomía 18 (síndrome de Edward), la trisomía 13 (síndrome de Patau), 45XO (síndrome de Turner) y 47xxy.

La sonda de ADN de translocación bcr/abl de leucemia mielógena crónica se utiliza ampliamente en la leucemia. El gen bcr en el cromosoma 22 se marcó con digoxigenina y el gen Abl en el cromosoma 9 se marcó con biotina y luego se detectó con fluoresceína roja y verde. La translocación cromosómica T(9;22)(q34;Q11) provoca la fusión de los genes bcr y Abl. En este momento, no es necesario detectar células en metafase. Si puede ver una mezcla de dos señales de color en las células en interfase, puede determinar que son células Ph positivas. Esto es particularmente cierto para la leucemia mieloide crónica en remisión después de la quimioterapia, donde se pueden encontrar fácilmente células leucémicas residuales. Otras, como la sonda de ADN de translocación t(15;17) y la sonda de ADN de translocación t(18;21), se pueden utilizar para el diagnóstico de leucemia promielocítica aguda (APL) y leucemia mieloide aguda (AML), respectivamente. Además, para el diagnóstico de leucemia, existen una sonda ISO (17q) de brazo isométrico en el cromosoma 16 y una sonda inv (16) en el cromosoma 16, ambas disponibles comercialmente.

Las sondas del gen HER-2/neu se utilizan ampliamente en tumores sólidos. La amplificación del gen Her/2-neu en células de cáncer de mama a menudo indica un mal pronóstico para el paciente. Antes de la tecnología FISH, todos los métodos para determinar la amplificación de genes utilizaban métodos clásicos de biología molecular (transferencia de South, etc.). ), pero en comparación con FISH, estos métodos no solo requieren mucho tiempo y mano de obra, sino que tampoco pueden observar el estado de la amplificación genética a nivel celular. La mayor ventaja de la tecnología FISH es que se puede observar evidencia directa de amplificación del ADN en los núcleos en interfase. El número y la intensidad de la fluorescencia de las señales de fluorescencia del ADN amplificadas mostradas por los núcleos en interfase a menudo están relacionados con el nivel de amplificación del ADN. En 1998, la FDA aprobó Herceptin como anticuerpo monoclonal para terapia génica, que puede usarse en combinación con quimioterapia para tratar a algunos pacientes con cáncer de mama metastásico avanzado. Aproximadamente el 25-30% de los pacientes con cáncer de mama tienen amplificación y/o sobreexpresión del gen HER-2/neu. Estos pacientes son aptos para el tratamiento con Herceptin Hace algún tiempo, la FDA aprobó el uso de la sonda de ADN del gen HER-2/neu de Vysis en el diagnóstico clínico del cáncer de mama. La amplificación o sobreexpresión del gen HER-2/neu también se observa en tumores malignos, como el cáncer de ovario, el cáncer de endometrio, los tumores de las glándulas salivales y el cáncer gástrico. Es previsible que las sondas de ADN del gen Herceptin y HER-2/neu puedan utilizarse para el tratamiento y diagnóstico de estos tumores en un futuro próximo. Actualmente están disponibles comercialmente otras sondas dirigidas a genes de tumores sólidos, como N-myc, C-myc, CyclinD 1, etc., pero aún no se han utilizado clínicamente. Los cambios cuantitativos en los cromosomas x, y, 21, 18 y 13 suelen estar relacionados con enfermedades congénitas. El número de cromosomas en células en división o en interfase se puede determinar utilizando ADN repetido centromérico como sonda. Por ejemplo, utilizando una sonda de pintura del cromosoma 21, se puede detectar la aparición del síndrome de Down en función del tamaño del área marcada.

Estudiar los cromosomas en tumores sólidos es difícil porque es complicado obtener suficientes células tumorales mitóticas.

Utilizando sondas específicas de centrómero, la variación del número de cromosomas en las células en interfase se puede analizar con buenos resultados. Por tanto, la tecnología FISH es de gran ayuda para el estudio de la citogenética tumoral. Hopman utilizó la tecnología FISH para estudiar el cáncer de vejiga y descubrió que faltaba el cromosoma 9. Los resultados de la detección de FISH fueron completamente consistentes con los resultados del análisis de citometría de flujo. Waldman et al. encontraron que los cambios en el número de cromosomas están estrechamente relacionados con la diferenciación y la estadificación del tumor. Por ejemplo, el cromosoma 7 se encuentra comúnmente en tumores avanzados y malignos con un grado estándar alto y un índice de etiquetado PCNA alto. Waldman cree que este fenómeno puede estar relacionado con el aumento o la supresión de ciertos genes especiales en el cromosoma 7. El uso de múltiples sondas cromosómicas marcadas con diferentes colores es más adecuado para estudiar la heterogeneidad de los cambios en el número de cromosomas en tumores sólidos.

La tecnología FISH puede ayudar a resolver cambios estructurales en los cromosomas que son difíciles de determinar como bandas G o Q. Muchos cromosomas marcadores inclasificables pueden identificarse mediante la tecnología FISH. Por ejemplo, Miura et al. informaron cambios cromosómicos en 21 casos de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), uno de los cuales tenía dos cromosomas marcadores. Después de la prueba FISH, se confirmó que se trataba de una deleción de microbandas en el brazo corto del cromosoma 9. Las bandas normales suelen ser difíciles de encontrar. Cuando se detecta con sondas genéticas específicas, la ausencia de señal en el lugar normal donde debería haber una señal fluorescente indica la presencia de un cromosoma. Lux et al. utilizaron el gen ankyrin como sonda para detectar los cromosomas y las células en interfase de pacientes con esferocitosis hereditaria y descubrieron que faltaba el gen. Al detectar 6 sitios diferentes cerca de la banda 3p21, Taguchi et al. compararon el cromosoma 3 anormal con el cromosoma 3 normal y determinaron que el mesotelioma pleural tiene una deleción de la banda 3p21, y especularon que puede haber diferencias importantes en esta región. Los genes supresores de tumores proporcionan pistas importantes para futuras investigaciones en biología molecular. La selección de sondas genéticas dispuestas en un orden determinado puede ayudar a determinar la naturaleza de las inversiones cromosómicas, especialmente las inversiones interdigitales. Por ejemplo, en la leucemia aguda, el cromosoma 16 está invertido. Se seleccionaron dos sondas cósmidas ubicadas proximal y distal al punto de ruptura, mientras que se usó una sonda centromérica para el cromosoma 16. La secuencia de señales de fluorescencia de las células normales es: cósmido-cósmido-centrómero, mientras que la señal de las células leucémicas cambia dos veces.

Las células híbridas suelen ser células de roedor que contienen un único cromosoma humano. Estas células híbridas se utilizan a menudo para mapear genes o generar bibliotecas de ADN específicas de un solo cromosoma. Los cromosomas humanos pueden perderse o reorganizarse fácilmente durante el cultivo de células híbridas. Por lo tanto, es necesario realizar exámenes citogenéticos regulares de las células híbridas, y estos cambios pueden detectarse fácilmente utilizando ADN genómico humano como sonda o la correspondiente sonda de frotis de cromosomas humanos. La tecnología FISH no sólo determina directamente la ubicación de una cadena de ADN en un cromosoma, sino que también proporciona un método sencillo para determinar la secuencia genética mediante el uso de marcadores de fluoresceína multicolores para controlar la aguja. Se pueden marcar dos cadenas de ADN diferentes con fluoróforos de diferentes colores cuando la distancia entre ellas en el cromosoma es superior a 1 Mbp, su orden en el cromosoma se puede distinguir en función de la relación de disposición de las diferentes señales de la sonda. Las células tratadas con 5-Burd pueden obtener cromosomas de alta resolución, aumentando así la resolución de las etiquetas de las cadenas de ADN en los cromosomas. Si se utilizan células en interfase, la distancia entre las dos cadenas de ADN se puede acortar a 50 Kbp, una vigésima parte de la distancia de resolución en el cromosoma. El orden de las diferentes sondas se puede determinar midiendo la distancia entre las células en metafase.

La determinación de la posición fina de la cadena de ADN en el cromosoma es adecuada para detectar algunas translocaciones y deleciones cromosómicas especiales, como la translocación que involucra al cromosoma q23 de 11, que se observa comúnmente en la leucemia aguda T (4; 11). En la leucemia linfocítica (LLA), T(6;11),5(9;11) en la leucemia mieloide aguda, t(11;19) se observa en la leucemia linfoblástica aguda y la leucemia mieloide aguda.

Al hibridar una misma cadena de ADN con los cromosomas de diferentes especies, podemos conocer los genes homólogos entre diferentes especies y sus posiciones en los cromosomas, entendiendo así la relación evolutiva entre especies. La amplificación del ADN suele aparecer como regiones de bandas anormales (ABRS) o regiones de heterocromatina (HSRS) y regiones telocéntricas (DM).

La expresión citogenética de la amplificación de estos genes ocurre en muchas neoplasias malignas. Comprender la amplificación de las cadenas de ADN (genes) en las células tumorales ayuda a comprender el proceso de proliferación maligna de los tumores. La amplificación de ciertos oncogenes en células inflamadas se puede utilizar como indicadores clínicos para predecir la progresión y el pronóstico del tumor. Por ejemplo, FISH puede localizar eficazmente el ADN específico amplificado en el cromosoma, especialmente cuando la citogenética encuentra la fuente y la ubicación de HSR o ABRS, puede inferir los genes tumorales que pueden amplificarse, detectando así deliberadamente ciertos genes que pueden usarse. para obtener rápidamente información directa y clara sobre la amplificación de genes. Cherif et al. utilizaron la tecnología FISH para descubrir la amplificación de C-myc en células de adenocarcinoma de colon, y la cadena amplificada de C-myc se reorganizó en el brazo largo del cromosoma 19. La pérdida de bandas estratégicas cromosómicas no se detecta fácilmente mediante bandas ordinarias. Cuando se utilizan sondas genéticas específicas para la detección, si no hay señal en el sitio que normalmente debería tener una señal fluorescente, significa que hay pérdida cromosómica. El gen ankyrin se utilizó como sonda para detectar los cromosomas y las células en interfase de pacientes con esferocitosis hereditaria, y se descubrió que el gen estaba eliminado. Algunos estudiosos han descubierto la eliminación de 6q23-24 en 21 (56,8) de 37 casos de linfoma de células B mediante tecnología FISH. Por lo tanto, se considera que este cambio tiene valor práctico en el diagnóstico del linfoma.