¿Qué son las plantas regeneradas de plantas medicinales cultivadas in vitro?

1. La importancia de la regeneración de plantas La biotecnología vegetal toma el cultivo de tejidos vegetales como método principal e incluye cinco ramas, a saber, el uso de tecnología in vitro para mejorar variedades de plantas y la rápida propagación de plantas económicas. y conservación a temperaturas ultrabajas de germoplasma, cultivo masivo de células vegetales e ingeniería genética vegetal. El cultivo in vitro de plantas medicinales implica, además de una gran cantidad de células vegetales, el cultivo de plantas regeneradas. A diferencia de las plantas comunes, al cultivar plantas regeneradas de plantas medicinales, es necesario prestar atención a los cambios en los ingredientes medicinales.

(1) Reproducción rápida

El propósito de la reproducción rápida se logra cultivando plantas regeneradas en grandes cantidades in vitro. Se utiliza principalmente para: (1) plantas con baja reproducción natural. tasa (2) rasgos Plantas híbridas inconsistentes, (3) plantas en peligro de extinción con recursos escasos (4) variedades excelentes recientemente cultivadas (5) variedades de excelente germinación y plantas individuales preferidas con características excelentes; del extranjero (7) algunas líneas endogámicas, materiales originales y descendientes híbridos que deben propagarse rápidamente durante el proceso de reproducción (8) plantas triploides y poliploides obtenidas mediante cultivo de tejidos o condiciones naturales; ) , bacterias y virus) plantas. La posibilidad de aplicar una tecnología de propagación rápida depende de: (1) la tecnología de cultivo es simple, estable y completa (2) el costo es menor que los métodos convencionales (3) ciertas condiciones de equipo y solidez técnica están disponibles; La demanda y el precio son adecuados. Como Luo Han Guo y Dendrobium nobile.

(2) Plantas libres de virus

Las plantas libres de virus con los virus principales eliminados se pueden obtener mediante cultivo de puntas de brotes, o mediante cultivo de pétalos y cultivo a largo plazo de callos. que pueden usarse como plantas madre. Mediante la producción en el campo, se puede obtener una gran cantidad de plántulas libres de virus, lo que puede mejorar el rendimiento y la calidad y prevenir la degradación de la variedad. Como Rehmannia glutinosa, crisantemo, etc.

(3) Preservación del germoplasma

A una temperatura baja de 4°C o en nitrógeno líquido, la vitalidad de los tejidos y células vegetales se puede mantener durante mucho tiempo. Los materiales vegetales que se pueden utilizar para la criopreservación incluyen: (1) puntas de brotes y meristemas laterales; (2) células vegetales cultivadas y cuerpos embrioides; (4) órganos vegetales, como embriones, endospermos y esporas. , anteras, polen y semillas. La congelación de material vegetal ahorra mano de obra, suelo y recursos materiales. Facilitar el intercambio regional e internacional de germoplasma y proporcionar materiales de mejoramiento y plántulas libres de virus mediante la propagación in vitro.

(4) Mejora de variedades

Los principales métodos de mejora de variedades vegetales mediante tecnología in vitro son: (1) Obtención de haploides mediante el cultivo de anteras, polen, células no fertilizadas y óvulos Plantas, realizan mejoramiento haploide; (2) Obtener plantas triploides mediante cultivo de endospermo, u obtener plantas poliploides mediante colchicina u otros factores en cultivo de tejido vegetal (3) Mediante variación clonal somática y detección de mutaciones celulares para obtener variantes y mutantes con características excelentes; Cultivo de protoplastos e hibridación celular. Independientemente de la tecnología de reproducción que se utilice, es necesario inducir la regeneración de las plantas e identificar su descendencia. Como ginseng, baya de goji, etc.

(5) Ingeniería genética vegetal

La ingeniería genética vegetal incluye el aislamiento de genes, el sistema de vectores y el sistema de receptores. Se dirige directamente a los genes que controlan la herencia de rasgos y puede mejorar las variedades con mayor precisión. Actualmente se han aislado y clonado más de 20 genes. El sistema de vector estudia principalmente el sistema de plásmido Ti de Pseudomonas aeruginosa (Agrobacterium T-DNA). Como sistemas receptores se pueden utilizar protoplastos, células en cultivo en suspensión, órganos vegetales in vitro procedentes de callos o plantas intactas. Independientemente del sistema receptor que se utilice, las células transformadas deben regenerarse hasta convertirse en plantas completas, y la regeneración de plantas es un paso importante en la ingeniería genética vegetal. Como las solanáceas y el glasto.

2. Principios básicos de la regeneración vegetal

La regeneración es un fenómeno común en el mundo biológico, y la regeneración biológica es el resultado de la selección natural y la selección artificial. Generalmente, los organismos inferiores tienen fuertes capacidades regenerativas, mientras que los animales superiores con sistemas nerviosos más desarrollados tienen capacidades regenerativas más débiles. En las plantas, las células, tejidos y órganos pueden crecer y desarrollarse fuera del cuerpo para formar una planta completa. Sin embargo, las células de diferentes tipos de plantas, o diferentes variedades de la misma planta, o incluso diferentes tejidos y órganos de la misma planta, tienen diferentes capacidades regenerativas. Generalmente, las plantas silvestres tienen capacidades de regeneración más fuertes que las plantas cultivadas, y las plantas asexuales tienen capacidades de regeneración más fuertes que las plantas propagadas con semillas.

La base de la regeneración vegetal radica en la totipotencia genética de las células, es decir, cada célula contiene toda la información genética para producir un organismo completo.

En condiciones adecuadas, el desarrollo y la diferenciación de una célula viva totipotente se controla mediante la activación o inhibición de ciertos genes en su ADN, y una célula puede formar un organismo completamente nuevo. La regeneración vegetal in vitro es el resultado de la desdiferenciación y rediferenciación de células cultivadas in vitro bajo la estimulación y acción de diversos factores ambientales. Puede deberse a que la diferenciación de las células vegetales es sólo relativamente estable. En el cultivo in vitro, es más probable que las células especializadas recuperen la totipotencia mediante la desdiferenciación, y las células totipotentes desdiferenciadas pueden luego diferenciarse para producir plántulas completas. La diferenciación es una cuestión central en la regeneración de plantas y está relacionada con muchos factores. Las hormonas vegetales son mensajeros químicos. Como "efectores" de la expresión genética, tienen un impacto directo en la síntesis de ARN y proteínas y desempeñan un papel importante y a veces decisivo en la desdiferenciación y rediferenciación celular.

Aunque muchas cuestiones aún no están claras, actualmente se cree que los principios básicos de la regeneración vegetal son: (1) totipotencia de las células vegetales; (2) desdiferenciación y rediferenciación de las células vegetales (3) hormona vegetal; balance. Estos principios básicos no son sólo principios rectores generales para el cultivo de tejidos, sino también algunos temas teóricos básicos para futuras investigaciones.

3. Vías básicas de regeneración vegetal

Existen dos vías básicas de morfogénesis de plantas regeneradas en cultivo in vitro, a saber, la organogénesis y la embriogénesis.

Algunos de estos dos tipos de morfogénesis pasan por una etapa de callo, mientras que otros se generan directamente en el tejido materno ex vivo.

Organogénesis

La forma de la organogénesis es formar una planta completa mediante la diferenciación de órganos, como caladio, azafrán, col, aloe, etc. La diferenciación de órganos en cultivo in vitro incluye la formación de yemas adventicias, raíces adventicias, bulbos, cormos, tubérculos, protocormos y flores. Hay tres formas en que las yemas y raíces adventicias forman plantas regeneradas: (1) primero se forman yemas y luego se producen raíces en las yemas (2) primero se forman raíces y luego se producen yemas en las raíces (3); ) Las yemas y las yemas se producen al mismo tiempo en el tejido del callo. Las raíces forman entonces un sistema vascular entre los brotes y las raíces, que los conecta en una estructura unificada en forma de eje. En la mayoría de los casos, es la primera forma. También existen diferentes situaciones de diferenciación a través de órganos como bulbos, cormos, tubérculos y protocormos.

En el cultivo de tejidos vegetales, aunque existen muchos informes sobre la regeneración de plantas mediante organogénesis, todavía hay muy poca información sobre investigación básica. La mayoría de las investigaciones continúan centrándose en la manipulación empírica de explantes, medios y condicionamiento ambiental. En la mayoría de los casos, las personas sólo pueden observar el estado de diferenciación que ya se ha expresado y es difícil rastrear el proceso de diferenciación. Actualmente no están claros los factores relacionados con el origen y la dirección de la morfogénesis. Entre estos factores se encuentran los cambios e interacciones de diversas sustancias en el sistema de cultivo in vitro, que se originan en el medio de cultivo, los explantes y sus metabolitos durante el proceso de cultivo.

En cultivo in vitro sólo se activan unas pocas células y la activación es asincrónica. Torrey (1966) propuso la hipótesis del meristemo, en la que la morfogénesis comienza con la masa de meristemo formada en el callo, es decir, el meristemo. Bajo la influencia de diversos factores en el sistema de cultivo, el tejido meristemático produce diferentes primordios, que forman raíces o brotes, o se convierten en cuerpos embrioides debido a las diferentes propiedades de los factores. Los meristemas pueden ocurrir en la interfaz del tejido y el medio de cultivo, y el sitio de su formación puede estar determinado por gradientes fisiológicos causados ​​por sustancias que se difunden desde el medio de cultivo hacia el tejido.

Skoog y Miller propusieron la hipótesis del equilibrio hormonal, que creía que la diferenciación de órganos está relacionada con la proporción de citoquininas y auxinas. En la mayoría de los casos, una alta proporción de auxina a citoquinina favorece la formación de raíces y viceversa favorece la formación de brotes. Muchas situaciones opuestas ocurren debido a la presencia de hormonas endógenas y la acumulación de sustancias inhibidoras en el explante. En la aplicación práctica de este principio, a veces es necesario agregar u omitir ciertas hormonas vegetales, y se deben considerar los siguientes factores: (1) el tipo y combinación de hormonas vegetales (2) la concentración absoluta de hormonas vegetales (; 3) hormonas vegetales, principalmente es la proporción de citoquinina a auxina; (4) el efecto secuencial de las hormonas vegetales; (5) otros factores, como explantes, condiciones nutricionales, tipos y concentraciones de fuentes de carbono y otros factores físicos y químicos.

(2) Embriogénesis

La regeneración de plantas por embriogénesis es la formación de cuerpos embrioides primero, y luego los cuerpos embrioides germinan para formar plantas completas. La embriogénesis es un fenómeno común en las plantas superiores y se ha observado que más de 150 especies de plantas pertenecientes a más de 40 familias tienen la capacidad de sufrir embriogénesis. Respecto al concepto de cuerpos embrioides, Zhu Kun propuso (1978) que los cuerpos embrioides son estructuras embrionarias que se originan a partir de células no cigóticas en cultivos de tejidos vegetales y se forman mediante embriogénesis y desarrollo embrionario.

Esta definición incluye los siguientes significados: (1) Los cuerpos embrioides son producto del cultivo de tejidos y su uso está limitado en cultivos de tejidos y son diferentes de los embriones apomícticos (2) Los cuerpos embrioides se originan a partir de células no cigóticas y son diferentes de los embriones cigóticos; (3) La formación de cuerpos embrioides pasa por el proceso de desarrollo embrionario, que es diferente de las yemas diferenciadas en el cultivo de tejidos.

Las fuentes de cuerpos embrioides se pueden dividir en cinco categorías: (1) tejidos y órganos; (2) callos; (3) células individuales libres; (4) microsporas. Algunos se originan a partir de células individuales y otros a partir de múltiples células. Hay dos formas de formar cuerpos embrioides (Sharp et al, 1980): (1) Directamente: los cuerpos embrioides se forman directamente a partir de un tejido de cultivo de células embrionarias predeterminado in vitro sin callo (2) Indirectamente: la embriogénesis se produce a través del callo; se desarrolla en células determinantes embrionarias inducidas. Bajo la influencia de factores relevantes en el sistema de cultivo, las células embrionarias continúan dividiéndose y proliferando, formando grupos de células embrionarias, que luego se convierten en embriones esféricos. Por lo general, las células embrionarias son de tamaño pequeño, tienen núcleos grandes, citoplasma denso y grandes gránulos de almidón. El tejido embrionario esférico se puede separar del tejido circundante, de forma similar al proceso de desarrollo de los embriones cigóticos. El embrión esférico se desarrolla y diferencia en embrión con forma de corazón, embrión con forma de torpedo y embrión maduro con cotiledones. El cuerpo embrioide maduro es similar en morfología al embrión cigótico, con radícula, embrión y cotiledones. En el medio de diferenciación, el cuerpo embrioide germina como una semilla, los hipocótilos se alargan, las hojas se desarrollan, las raíces se desarrollan y forman clorofila y varios órganos crecen para formar pequeñas plantas. La formación de cuerpos embrioides condujo al desarrollo de semillas artificiales.

La embriogénesis hasta la formación de la planta es un proceso continuo, que se puede dividir en tres etapas consecutivas: (1) Origen del cuerpo embrioide; (2) Diferenciación del cuerpo embrioide (3) Germinación del cuerpo embrioide y crecimiento para formarse; plantas pequeñas. En la práctica, los procesos de desarrollo de inducción de células embrionarias y formación de cuerpos embrioides pueden ocurrir en el mismo medio de cultivo o pueden requerir dos cultivos separados. Cuando los cuerpos embrioides forman plantas verdes, es necesario transferirlos a un medio de diferenciación. Si los químicos del medio de cultivo, principalmente hormonas vegetales, están desequilibrados. Se inhibirá la diferenciación de las células embrionarias y el desarrollo de los cuerpos embrioides, y aparecerán bloques de tejido embrionario anormales. Estas estructuras malformadas también pueden tener potencial embriogénico.

La relación entre la embriogénesis y las hormonas vegetales varía de una planta a otra y se puede dividir en varios tipos:

1. Tipo de auxina específico

La embriogénesis debe tener La La presencia de auxinas y otras hormonas vegetales ejercen efectos inhibidores. Hay dos situaciones de este tipo: (1) la auxina es necesaria para la inducción de células embrionarias, y la auxina, como las zanahorias, es necesaria para reducir o eliminar la formación y el desarrollo de cuerpos embrioides; (2) la inducción y el desarrollo de cuerpos embrioides; cuerpos embrioides El desarrollo se puede realizar en el mismo medio auxínico. Como el ginseng.

2. Tipo de auxina inespecífico

La embriogénesis requiere auxina, y otras hormonas vegetales como las citoquininas, giberelinas o el ácido abscísico tienen efectos sinérgicos en cierta proporción, como la azufaifa.

3. Tipo no auxínico

La embriogénesis no requiere auxinas y puede formarse en medios de citoquininas, como el sándalo.

4. Tipo no hormonal

La embriogénesis no requiere hormonas vegetales, como el cultivo de flores de datura.

Los cuerpos embrioides suelen necesitar reducir o eliminar auxinas para diferenciarse en plántulas verdes. Las citoquininas y las giberelinas desempeñan un papel importante, como el ginseng y el ginseng americano.

Los compuestos nitrogenados reductores juegan un papel importante en la embriogénesis somática. Los compuestos de nitrógeno reducido incluyen nitrógeno inorgánico, tal como NH+4, compuestos de nitrógeno orgánico, tales como aminoácidos, amidas, caseína hidrolizada, etc. En circunstancias normales, la reducción de nitrógeno es beneficiosa para la formación de cuerpos embrioides, pero el mecanismo de acción aún no está claro y cada planta responde de manera diferente. Muchos estudios han demostrado que la relación de concentración de auxina y nitrógeno reducido puede desempeñar un papel importante.

Diferentes plantas y diferentes cultivos in vitro pueden tener diferentes formas de regenerarse. Algunas se producen principalmente a través de órganos, como el tabaco, y otras producen fácilmente cuerpos embrioides, como las zanahorias. Sin embargo, muchas plantas pueden regenerarse mediante organogénesis y embriogénesis, que pueden ser reguladas por hormonas vegetales, como el ginseng y el ginseng americano. Generalmente se requieren citoquininas para inducir la diferenciación de las yemas y las auxinas desempeñan un papel importante en la inducción de la formación de cuerpos embrioides.

En el cultivo in vitro se diferencian las yemas y los cuerpos embrioides. Sus principales diferencias son: las yemas son unipolares y tienen conexiones de tejido vascular con las raíces y las yemas no se producen al mismo tiempo; El cuerpo es bipolar, es decir, tiene una punta de raíz (radícula) y una punta de brote (embrión). No tiene conexión directa con el cultivo in vitro, por lo que es una forma de embrión vegetal completo. El desarrollo de la embriogénesis somática condujo al desarrollo de semillas artificiales.

Cuarto, factores limitantes de la regeneración de las plantas

(1) Factores limitantes de la regeneración de las plantas

Las plantas regeneradas cultivadas in vitro se pueden dividir en tres tipos de factores reguladores : Explantes, medios y condiciones ambientales. Entre estos tres factores, aunque todos juegan un papel importante, en comparación, el factor limitante para una regeneración exitosa de las plantas no es el medio de cultivo, sino el material de cultivo en sí, es decir, el grado de expresión de la totipotencia celular en el material de cultivo.

1. Influencia del genotipo

La capacidad de regeneración de las diferentes especies de plantas varía mucho, y algunas tienen una fuerte capacidad de regeneración, como Solanaceae, Umbelliferae, Brassicaceae, etc. Algunas son difíciles de regenerar, como las legumbres. Diferentes variedades de la misma planta tienen diferentes capacidades regenerativas. Debido a la influencia del tipo genético se determinan la dificultad y las perspectivas de aplicación de la regeneración vegetal. Cuando estudiamos el cultivo de embriones de las plantas medicinales Araliaceae ginseng, ginseng americano, Panax notoginseng y Acanthopanax, obtuvimos los siguientes resultados: (1) En el medio de cultivo suplementado con BA2mg/l+NAA0,5mg/l, el cultivo de embriones de ginseng y el ginseng americano puede iniciar directamente la diferenciación de las yemas y, cuando se transfiere a un medio que contiene giberelina, se formarán yemas adventicias, mientras que Panax notoginseng y Acanthopanax no tienen diferenciación de yemas. (2) En el medio que contiene auxina, existen cuerpos embrioides en los cultivos de embriones de estas cuatro plantas medicinales, pero tienen diferentes respuestas al tipo y concentración de auxina. Cuando se añadió 2,4-D 0,5-1,0 mg/L, la capacidad de embriogénesis fue de ginseng americano > Panax ginseng > Acanthopanax senticosus, mientras que no se observó embriogénesis en Panax notoginseng. En medios que contenían IAA, las altas concentraciones de IAA promovieron la embriogénesis somática de las semillas de ginseng, mientras que las bajas concentraciones de IAA fueron adecuadas para Panax notoginseng y Acanthopanax senticosus. (3) En las condiciones de auxina anteriores, el ginseng y el ginseng americano se someten a una embriogénesis indirecta, mientras que el Panax notoginseng y el Acanthopanax se someten a una embriogénesis directa.

2. Fuente de los explantes

Cultivo in vitro, existen muchos materiales que se pueden utilizar para el cultivo, incluidos órganos, tejidos e incluso células individuales. Aunque las células vegetales son totipotentes, su expresión puede estar restringida a ciertas células especializadas, que pueden ser preexistentes en el explante o pueden generarse durante el cultivo. Muchos experimentos han demostrado que las características del material de cultivo afectan no sólo a la posibilidad de regeneración, sino también a la tasa de crecimiento y la calidad de las plantas. Al seleccionar materiales de cultivo, se puede observar que los meristemas son fáciles de diferenciar, las bases de los cotiledones se regeneran fuertemente, las hojas adultas de los árboles pueden tener poca reversibilidad y la totipotencia celular es difícil de expresar. Cuando estudiamos plantas de ginseng americano regeneradas in vitro, los callos de diferentes explantes mostraron diversos grados de totipotencia celular (Tabla 13-10).

Tabla 13-10 Grado de expresión de totipotencia de células de callo en diferentes explantes de ginseng americano

3. Estado de los explantes

Etapa de desarrollo y edad de los explantes, endógenos. las hormonas y el estado fisiológico del explante (temporada de muestreo), el tamaño del explante, el pretratamiento del explante y la calidad de la planta madre afectan el éxito de la regeneración de la planta. Al seleccionar explantes, es necesario comprender la biología de la planta.

(2) Tipo y selección de explantes

Para el cultivo in vitro, los explantes vienen en una variedad de materiales y pueden seleccionarse según el propósito de la investigación, la vía de regeneración y la experiencia experimental.

1. Explantes de yemas

Incluyendo cabezas de tallo, yemas laterales, protocormos, bulbos, etc. Estos explantes tienen una alta tasa de éxito, baja variabilidad y son fáciles de mantener las excelentes características del material. Generalmente se utilizan para la rápida propagación y cultivo de plantas libres de virus (cultivo de puntas de brotes). En cultivo, para inducir el alargamiento del eje del tallo, a menudo se añaden auxinas y giberelinas al medio de cultivo; si se induce el crecimiento de yemas axilares para producir yemas agrupadas, suele haber una gran cantidad de citoquinina en el medio de cultivo.

2. Explantes compuestos por tejidos diferenciados

Incluyendo segmentos de tallo, hojas, raíces y otros órganos vegetativos, tallos florales, pétalos, cáliz, anteras, ovarios, óvulos y frutos y otros; órganos reproductivos. Estos explantes suelen formar callos durante el cultivo y regenerar las plantas mediante organogénesis y embriogénesis. Las plantas para la regeneración de organogénesis generalmente seleccionan órganos y tejidos que pueden producir yemas adventicias en condiciones naturales. La selección debe basarse en las características de diferentes plantas, como el aloe vera para los segmentos de tallo, el crisantemo para los pétalos y el lirio para las escamas.

Los embriones, las inflorescencias jóvenes y los meristemas se utilizan a menudo como explantes mediante embriogénesis. Dichos explantes se pueden utilizar para variación clonal y selección de mutantes, o para reproducción de haploides, como plantas de polen.

3. Los explantes compuestos por células genéticamente transformadas

Se refieren principalmente al sistema de transformación de la agalla de la corona y al sistema de transformación directa del ADN utilizados en la ingeniería genética vegetal.

Verbo (abreviatura del verbo) Método de cultivo de plantas regeneradas

(1) Pasos de cultivo de plantas regeneradas

1. Establecer un cultivo estéril.

Este paso incluye la selección del explante, la esterilización superficial del material y la inoculación en el medio de cultivo. La capacidad de obtener cultivos estériles depende de la condición del material vegetal. Siempre que sea posible, utilice material sano y vigoroso cultivado en una sala de cultivo o invernadero. La desinfección de los materiales de campo es difícil, por lo que a menudo se utilizan los siguientes métodos: (1) Pretratar las plantas con soluciones antibióticas y fungicidas; (2) Envolver las ramas con bolsas de plástico (3) Recolectar ramas para esquejes y usar brotes nuevos; ) Esterilice el material de cultivo varias veces. Algunos explantes de plantas se volvieron marrones después de la inoculación y durante el cultivo. Al medio de cultivo se le pueden añadir algunos antioxidantes, desintoxicantes o adsorbentes, como ácido cítrico, ácido ascórbico, cisteína, polivinilpirrolidona, ditiotreitol, promotores de crecimiento, cloranfenicol, disulfuro de dietilo uretano, carbón activado, etc. , para mejorar las condiciones de dorado.

2. Cultivo de callos

El callo es la etapa más común en el cultivo de tejidos vegetales. Para propagar rápidamente líneas de élite genéticamente consistentes con una variación inferior al 3%, es necesario evitar los callos tanto como sea posible. Sin embargo, en el mejoramiento de variedades, la inducción de callos es beneficiosa.

El callo suele producirse a partir de las células superficiales de la herida del explante. Las características de crecimiento de los callos dependen del material vegetal, el medio de cultivo y las condiciones ambientales. Desde el explante hasta el establecimiento del callo, generalmente pasa por varias etapas de inducción, división celular y diferenciación. Bajo la influencia de condiciones externas, especialmente hormonas vegetales, se forma un pequeño número de células, se fortalece su metabolismo y entran en una división celular activa. Las células explantadas se transforman en meristemas o se desdiferencian en callos. El crecimiento del callo no tiene una polaridad obvia, solo la pendiente del crecimiento interno y externo, y las células periféricas se dividen y crecen más rápido que las células internas. En la tercera etapa, el callo se diferencia y produce algunos metabolitos secundarios. La característica más importante del callo es que puede formar raíces, brotes y cuerpos embrioides mediante organogénesis o embriogénesis, para luego formar pequeñas plantas.

Las llamadas suelen ser de color amarillo claro, blanco o verde, y algunas contienen antocianinas para formar el color. Hay tipos de callos sueltos y densos. En el subcultivo, se puede seleccionar artificialmente tejido de callo de la misma fuente para obtener diferentes líneas celulares. Varían mucho en diferenciación celular, color, tasa de crecimiento, requisitos de condiciones nutricionales y hormonales y capacidad de sintetizar sustancias especializadas. La variación es otra característica importante del callo. Estas variaciones incluyen variación fenotípica y variación genotípica. La variación genotípica puede incluir cambios de ploidía, aberraciones cromosómicas y cambios en la secuencia de genes. La selección de variaciones beneficiosas se puede utilizar para mejorar la raza.

La relación entre la formación de callos del explante y las hormonas vegetales es la siguiente: (1) Solo se requiere auxina; (2) Solo se requiere citoquinina (3) Se requieren tanto auxina como citoquinina; hormonas vegetales necesarias. En la mayoría de los casos, la auxina es el factor principal en la inducción del callo.

Durante el proceso de cultivo, debido al agotamiento paulatino de nutrientes, el agar se deshidrata y se seca progresivamente, y se acumulan metabolitos, aumentando la toxicidad. El cultivo de callos requiere transferencia a un medio fresco durante un período de subcultivo. En medios sólidos, el subcultivo suele realizarse cada 4-6 semanas. El cultivo transferido tiene un tamaño aproximado de 5 a 10 mm y pesa aproximadamente de 20 a 100 mg (Street, 1969). Si el tamaño es demasiado pequeño, es posible que crezca lentamente o no crezca en absoluto, pero cuando se analiza la resistencia, el tamaño del cultivo es más pequeño. Los componentes y las condiciones hormonales del medio de subcultivo de callos y del medio de desdiferenciación pueden ser iguales o diferentes y varían de una planta a otra. Dado que el subcultivo a largo plazo aumenta el contenido de hormonas endógenas, es necesario ajustar adecuadamente el tipo y el contenido de hormonas en el medio de subcultivo.

3. Establecimiento de clones

El establecimiento de clones a partir de cultivo in vitro a menudo encuentra problemas como mutaciones, pérdida de la capacidad de diferenciación celular y plántulas en vidrio. El cultivo in vitro de cada planta requiere de una gran cantidad de experimentos para determinar las condiciones óptimas de cultivo y programarlas para lograr el propósito de aplicación. El método para establecer un clon se puede representar aproximadamente en la Figura 13-2.

Figura 13-2 Diagrama esquemático del establecimiento de clonación 4. Enraizado

La facilidad de los cogollos y yemas para inducir el enraizamiento depende en primer lugar del tipo genético de la planta. Las hierbas son generalmente más fáciles de plantar que las plantas leñosas. Los árboles adultos producen brotes y ramas que son más difíciles de enraizar que los árboles jóvenes. Para inducir el enraizamiento, normalmente se añaden al medio de enraizamiento cantidades apropiadas de auxinas, tales como ácido naftilacético, ácido indolbutírico y ácido indolacético. Algunas plantas pueden enraizar en medios libres de hormonas. El medio de enraizamiento puede ser el mismo que el medio anterior de uso común con alto contenido de sal con una concentración de 1/2, 1/3 o 1/4 o un medio con una baja concentración de sal total. Las sales de hierro son beneficiosas para la formación de raíces y generalmente mantienen la concentración original. La sacarosa es necesaria para el enraizamiento y diferentes plantas pueden requerir diferentes cantidades.

Para algunas plantas que son difíciles de enraizar, puedes probar otros métodos: (1) Pretratar con una solución de auxina de alta concentración durante varias horas, luego enjuagar con agua esterilizada e inocular en una hormona. medio libre; (2) ) Utilice puente de papel de filtro o vermiculita en lugar de agar como portador para inducir el enraizamiento (3) Agregue algunos aditivos al medio de enraizamiento, como carbón activado, B9, dimetilsulfóxido, florizina, floroglucinol, etc. (4) Inducir órganos latentes en tubos de ensayo, como pequeños tubérculos, pequeños bulbos y tallos subterráneos (5) Cortar ramitas, ya sea directamente o hidropónicamente;

Trasplante

Algunas plantas son fáciles de trasplantar. Por ejemplo, la tasa de supervivencia de las plántulas de aloe vera en probeta trasplantadas directamente al suelo puede alcanzar el 100%, aunque no hay informes exitosos. de trasplantar plántulas de tubo de ensayo de ginseng. Para muchas plantas, es necesario estudiar sus técnicas especiales de trasplante.

(1) Cultivar plántulas fuertes y ejercitarlas antes del trasplante.

(2) Transición gradual: La primera es la matriz artificial, como vermiculita, arena, perlita, ceniza, suelo central, etc. introducido en el suelo. Para las plantas susceptibles a enfermedades, los sustratos artificiales se pueden esterilizar mediante alta temperatura, esterilización química o desinfección química.

(3) Elegir el periodo de trasplante adecuado. Muchas plantas leñosas y algunas plantas herbáceas sobreviven mejor cuando sus primordios radiculares sobresalen o forman raíces de tan solo unos pocos milímetros. Algunas plantas herbáceas pueden inducirse mediante enraizamiento secundario. Una vez que el primer enraizamiento ha envejecido, se pueden inducir y trasplantar nuevas raíces.

(4) Controlar las condiciones ambientales del trasplante, mantener una alta humedad y buena ventilación, y evitar la luz solar directa y las fluctuaciones excesivas de temperatura. Algunas plantas necesitan simular su entorno ecológico.

(5) Prevenir y controlar oportunamente las enfermedades. Una enfermedad común es la marchitez, y se pueden usar pesticidas como el carbendazim para rociar regularmente las plántulas y los sustratos.

(6) Injerto de plántulas en probeta.

(2) Medio y condiciones ambientales

1. Medio

El cultivo de tejidos vegetales se puede dividir en muchos tipos según los materiales y propósitos del cultivo, como el órgano. cultivo, cultivo de puntas de brotes, cultivo de anteras y polen, cultivo de ovarios y óvulos, cultivo de embriones, cultivo de endospermo, cultivo de frutos, cultivo de suspensiones celulares, cultivo de meristemas, cultivo de callos, cultivo de protoplastos y fusión celular. Diferentes plantas y diferentes tipos de cultivo de tejidos requieren diferentes medios. Actualmente, existen aproximadamente 250 tipos de medios disponibles para el cultivo de tejidos vegetales. Para la propagación in vitro general, con el fin de reducir los costos de producción, algunos utilizan medios de cultivo simplificados, utilizando azúcar comestible en lugar de reactivos y sacarosa, y agua corriente en lugar de agua destilada para preparar el medio de cultivo. El cultivo líquido estático a poca profundidad puede reducir los costos entre un 70% y un 80% en comparación con el cultivo sólido en agar y se ha utilizado para la rápida propagación de algunas plantas.

2. Condiciones ambientales

Incluyendo el valor de pH del medio de cultivo, temperatura de cultivo, condiciones de iluminación y condiciones de ventilación.

Generalmente, el pH óptimo para el crecimiento del tejido vegetal está entre 5 y 6,5. El medio sólido suele tener un pH de 5,8 y el medio líquido suele tener un pH de 5,0.

La temperatura del cultivo suele rondar los 20-28°C. Las temperaturas altas (alrededor de 27°C) son adecuadas para las variedades tropicales, y las temperaturas bajas (alrededor de 20°C) son beneficiosas para el cultivo in vitro de plantas alpinas. Cuando en los tubos de ensayo se forman órganos latentes, como bulbos y tubérculos, su germinación suele requerir un tratamiento a baja temperatura.

El cultivo de callos generalmente se puede realizar en la oscuridad. Se requiere luz para el cultivo fotoautótrofo in vitro, el desarrollo de órganos y la formación de plantas. El rango de intensidad de la luz es 300-1000-3000lx, generalmente 1000-3000lx. Generalmente, la sala de cultivo se puede diseñar para utilizar luz natural en lugar de lámparas fluorescentes. Los estudios han demostrado que la luz coloreada de diferentes longitudes de onda tiene un cierto impacto en la formación de callos y la diferenciación de órganos, y varía según las especies y órganos de las plantas. El tiempo de iluminación depende de las características de la planta y de los propósitos experimentales, y puede ser iluminación continua o periódica durante 10 a 16 horas. La formación de tubérculos y otros órganos de almacenamiento puede requerir un largo período de oscuridad.

Al estudiar la organogénesis floral es necesario controlar la duración de la luz según las características de la planta.

Generalmente, los componentes del aire no se pueden considerar en medios sólidos, aunque durante el proceso de cultivo se produce etileno. El cultivo líquido requiere ventilación. El cultivo en suspensión celular generalmente utiliza un método de agitación para la aireación. En la diferenciación de órganos, se puede utilizar un lecho giratorio para hacer crecer tejidos a intervalos en un medio líquido. El cultivo líquido poco profundo estático de pequeño volumen requiere un tiempo de cultivo más corto y un paso cada cuatro semanas. Para preservar el material de propagación, aún se debe utilizar cultivo sólido.

Verbo intransitivo Descripción general de la investigación sobre la regeneración in vitro de plantas medicinales chinas

En el cultivo y producción de plantas medicinales, muchas plantas medicinales preciosas tienen un ciclo de crecimiento largo y los métodos convencionales son acostumbrado a La cría lleva mucho tiempo, como el ginseng, coptis, etc. Algunas plantas medicinales, como el caladio, el azafrán, etc. El coeficiente de reproducción es pequeño y el consumo de semillas es grande. Algunas son degradadas por virus afectando el rendimiento y la calidad, como Rehmannia glutinosa, Radix Pseudostellariae, etc. Algunas plantas medicinales silvestres caras tienen pocos recursos y crecen lentamente, como Polygonum nigra, Dendrobium Huoshan, etc. Algunos materiales medicinales importados del sur, como el incienso y la sangre de dragón, se han visto afectados por la escasez de Miao. Con el fin de aplicar la biotecnología vegetal para el mejoramiento de variedades, la rápida propagación, la preservación del germoplasma y la investigación de ingeniería genética de plantas medicinales, la investigación y aplicación de la regeneración in vitro de plantas medicinales ha atraído cada vez más atención.

En la actualidad existen más de 100 tipos de plantas medicinales in vitro, como la Acanthaceae Nine Lions. Familia del kiwi, género Macaca. Especie Actinidia tomentosa var. hispide, bígaro Apocynaceae, adelfa, rauwolfia, eleuthero, ginseng, ginseng de bambú, ginseng americano, ginseng americano, notoginseng, notoginseng, ascidia india.