Método para la determinación del contenido de proteínas.
Los diez métodos para medir el contenido de proteínas son los siguientes:
1. Método UV de medición directa:
Este método prueba directamente las proteínas a una longitud de onda de 280 nm. Seleccione la fórmula de Warburg y el fotómetro podrá mostrar directamente la concentración de la muestra o seleccionar el método de conversión correspondiente para convertir el valor de absorbancia en la concentración de la muestra. El proceso de determinación de proteínas es muy simple: primero pruebe la solución en blanco y luego pruebe la proteína directamente. Esto hace que los resultados parezcan inestables. El método de cuantificación directa de proteínas es adecuado para probar proteínas relativamente puras con componentes relativamente únicos.
Comparado con el método colorimétrico, el método cuantitativo directo UV es rápido y sencillo de operar; sin embargo, es susceptible a la interferencia de sustancias paralelas, como el ADN, además, tiene baja sensibilidad y requiere una; alta concentración de proteínas.
2. Método de absorción ultravioleta:
Principio experimental: la mayoría de las estructuras moleculares de las proteínas contienen residuos de aminoácidos aromáticos (tirosina y triptófano), lo que hace que la proteína absorba a 280 nm. absorción máxima, y el valor de absorción en este rango de longitud de onda es proporcional a la concentración de proteína. Esta característica se puede utilizar para determinar cuantitativamente el contenido de proteína.
El método de absorción ultravioleta puede medir soluciones de proteínas de 0,1-0,5 mg/ml. Esta operación es sencilla, la medición es rápida, no se consume muestra y las sales de baja concentración no interfieren con la medición. Por tanto, este método es muy utilizado en la preparación de proteínas.
3. Método Biuret:
Principio experimental: El biuret (NH3CONHCONH3) es un producto que se obtiene calentando dos moléculas de urea a unos 180°C para liberar una molécula de amoniaco. En una solución alcalina fuerte, el biuret y el CuSO4 forman un complejo violeta, que se denomina reacción de biuret. Cualquier compuesto con dos grupos amida o dos enlaces peptídicos conectados directamente, o un enlace peptídico que pueda conectarse a través de un átomo de carbono intermedio, tiene una reacción de biuret.
El color del complejo morado es proporcional a la concentración de proteínas y no tiene nada que ver con el peso molecular de las proteínas ni con la composición de aminoácidos, por lo que puede utilizarse para determinar el contenido de proteínas. El rango de medición es de 1 a 10 mg de proteína. Las principales sustancias que interfieren con esta determinación incluyen: sulfato de amonio, tampón Tris y ciertos aminoácidos.
IV.Método BCA:
Principio experimental: El método de detección BCA es un método mejorado del método de determinación de Lowry. En comparación con el método Lowry, el método BCA es más sencillo de operar, los reactivos son más estables, casi no hay influencia de sustancias que interfieren, la sensibilidad es mayor (la microdetección puede alcanzar 0,5 μg/ml) y la aplicación es más flexible. Los enlaces peptídicos en las moléculas de proteínas pueden complejarse con Cu2 para formar un complejo en condiciones alcalinas y, al mismo tiempo, reducir Cu2 a Cu.
El ácido bicinconínico y su sal de sodio son compuestos solubles en agua. En condiciones alcalinas, pueden combinarse con Cu para formar un compuesto de color púrpura oscuro. Este compuesto estable tiene una longitud de onda fuerte a 562 nm. la profundidad del color del compuesto es proporcional a la concentración de la proteína. Por lo tanto, se pueden utilizar métodos colorimétricos para determinar el contenido de proteínas.
5. Método Lowry:
Principio experimental: El enlace peptídico de la proteína se quela con Cu2 en una solución alcalina para formar un complejo proteína-cobre. Este complejo forma el reactivo fenol ácido fosfomolíbdico. se reduce para producir un compuesto azul. Bajo ciertas condiciones, la relación lineal entre la profundidad del azul y la concentración de proteína se usa para hacer una curva estándar y medir la concentración de proteína en la muestra.
6. Método Coomassie Brilliant Blue:
Principio experimental: El método Coomassie Brilliant Blue se utiliza para determinar la concentración de proteínas utilizando el principio de unión proteína-tinte para determinar cuantitativamente las concentraciones de trazas de proteínas rápidamente. y eficientemente. Coomassie Brilliant Blue G-250 existe en dos formas de color diferentes, rojo y azul. Se une a las proteínas mediante fuerzas de Van der Waals. Dentro de un determinado rango de concentración de proteínas, la unión de proteínas y colorantes cumple la ley de Beer.
Después de que este tinte se combina con la proteína, su color tiene forma roja y azul. La absorción de luz máxima cambia de 465 nm a 595 nm. Al medir el aumento en la absorción de luz a 595 nm, la cantidad de proteína unida. se puede saber.
La combinación de proteína y colorante es un proceso muy rápido. La reacción se completa en aproximadamente 2 minutos, muestra una máxima absorción de luz y puede permanecer estable durante 1 hora. Después de eso, el complejo proteína-colorante se polimeriza y precipita.
7. Método de determinación de nitrógeno de Kjeldahl:
Principio experimental: el método de determinación de nitrógeno de Kjeldahl se utiliza para determinar el contenido de nitrógeno de la materia orgánica. Si se conoce el contenido de nitrógeno de las proteínas, entonces esto. El método se puede utilizar para determinar el contenido de proteínas en una muestra. Cuando la proteína se calienta con ácido sulfúrico concentrado, los elementos de carbono e hidrógeno que contiene se oxidan en dióxido de carbono y agua, mientras que el nitrógeno se convierte en amoníaco y luego reacciona con el ácido sulfúrico para formar sulfato de amonio. Este proceso a menudo se denomina "digestión".
Sin embargo, esta reacción avanza relativamente lentamente. Generalmente se agrega sulfato de potasio o sulfato de sodio para aumentar el punto de ebullición de la solución de reacción, y se agrega sulfato de cobre como catalizador para promover la reacción.
8. Kit de determinación del método de Lowry:
El método del reactivo folin fenol incluye una reacción de dos pasos: el primer paso es generar un complejo proteína-cobre en condiciones alcalinas mediante la interacción de proteína y cobre El complejo; el segundo paso es que el complejo reduce el reactivo de Folin para producir un color azul oscuro, cuya profundidad es proporcional al contenido de proteína. El rango cuantitativo es de 5~100μg/ml de proteína. La reacción de color del reactivo Folin es causada por tirosina, triptófano y cisteína, por lo que si la muestra contiene fenoles, ácido cítrico y compuestos sulfhidrilo, tendrán efectos de interferencia.
Además, diferentes proteínas tienen una intensidad de color ligeramente diferente debido a los diferentes contenidos de tirosina y triptófano.
9. Kit de determinación del método BCA:
En condiciones alcalinas, la proteína reduce el Cu2 a Cu, y el Cu forma un complejo violeta con el reactivo BCA, que se mide a 562 nm. El valor de absorción en la muestra se puede comparar con la curva estándar para calcular la concentración de la proteína que se va a analizar. Las concentraciones comúnmente utilizadas de los detergentes SDS, TritonX-100 y Tween no afectan los resultados de la prueba, pero sí se ven afectadas por agentes quelantes (EDTA, EGTA), agentes reductores (DTT, mercaptoetanol) y lípidos.
Durante el experimento, si descubre que el valor de fondo de la dilución de la muestra o del lisado en sí es alto, puede probar el kit de determinación de concentración de proteína Bradford.
10. Método espectrofotómetro.
1. Tome ocho (o más) tubos de centrífuga limpios de 10 ml y márquelos con números.
2. Tomar 100ulBSA y añadir 2,4ml de PBS para diluirlo hasta una concentración final de 0,2mg/ml.
3. Invierta la solución de tinción 5×G250 de 3 a 5 veces antes de usar. Tome 10 ml de solución de tinción 5×G250, agregue 40 ml de agua bidestilada y mezcle para formar una solución de tinción 1×G250. Esta solución de tinción 1× G250 se puede almacenar a 4°C durante una semana.
4. Añadir reactivos según tabla (basado en 5ml por pocillo, el exceso se utiliza para limpiar la cubeta).