¿El proceso de aislamiento de células del músculo liso vascular?
1.1 Materiales
El suero bovino fetal, DMEM, tripsina e isotiocianato de guanidinio son productos de GIBCO. El anticuerpo monoclonal anti-actina del músculo liso y el kit de etiquetado de cebadores aleatorios fueron productos del plásmido PA-2.2 de Promega, donado por el profesor Rubin de la Universidad de California. ¿Cuál es la actividad específica del a-32PdCTP? TBq/mmol es un producto de British Amersham Company; la membrana de nitrocelulosa es un producto de Swedish Pharmacia Company.
1.2 Método
1.2.1 Materiales: Se seleccionaron ratones C57BL/6 sanos (ratones transgénicos y ratones control), con un peso de 18 ~ 22 g [5]. Después de ser anestesiado mediante una inyección intraperitoneal de 2,5 mg de Adfor, le extirparon el globo ocular y murió desangrado. Luego empape todo el ratón en etanol al 75% durante 3 a 5 segundos y use tijeras para tejidos para abrir el cofre capa por capa.
1.2.2 Cultivo primario y pasaje: El corazón y la aorta se perfundieron tres veces con solución de Hank del ventrículo izquierdo y luego se lavaron tres veces con solución de tripsina 0,05. Luego, el tejido graso de la superficie de la aorta y el corazón se extrae mediante oftalmología. La aorta se empapó en solución DMEM sin suero durante 65.438 ± 00 min. Luego colocar en DMEM que contenga 10 NCS durante 10 min, cortar en trozos en un vial de penicilina y enjuagar con DMEM. Dejar reposar 5 minutos, succionar el tejido suspendido y el sobrenadante, cortar y lavar nuevamente los trozos de tejido precipitado, dejar reposar 5 minutos, repetir 2 a 3 veces. Utilice una pipeta de codo para inocular uniformemente el bloque de tejido en una botella de cultivo de 25 ml e invertirlo. Añadir 3 ml de medio DMEM que contenga 20 NCS, colocarlo en una incubadora que contenga 95 de aire y 5 de CO2 y cultivar a 37 °C durante 4 a 5 horas. Voltee suavemente la botella de cultivo in situ para remojar los trozos de tejido adherentes en el medio de cultivo y cultívelos durante 3 días. En los días 5 a 7, las células fusiformes crecen a lo largo del borde del bloque de tejido y en los días 10 a 14, crecen células densas. Después de 3 semanas, las células se pueden recolectar en pedazos y transmitirse. Cuando las células estén llenas, vierta el medio de cultivo, agregue 3 ml de 10 NCS DMEM, sople repetidamente con una pipeta e inocule en una nueva botella de cultivo en la proporción requerida para continuar con el cultivo. Generalmente se pasará en 3 a 5 días.
1.2.3 Criopreservación y recuperación celular: Tomar células en fase de crecimiento logarítmico y cambiar el medio 24 horas antes de recolectar las células. Digerir las células según el método de paso, agregar 20 NCS y 10 DMSO gota a gota en el tubo de centrífuga para hacer una suspensión celular de 5×106, dividirla en varios crioviales, cada tubo es de 1,5 ml, mantener durante la noche a 4 °C. y envuélvalo con una gasa a la mañana siguiente. Enfríe el tubo de criopreservación a -25°C a una velocidad de 1 a 2°C/min, y luego a -70°C a una velocidad de 5 a 60°C. Saque las células criopreservadas del nitrógeno líquido y colóquelas inmediatamente en un baño de agua a entre 38 y 40 °C, agítelas rápidamente para descongelarlas y transfiéralas a un tubo de centrífuga que contenga 5 ml de medio de cultivo completo. Centrifugar a 65438±0 000 rpm durante 65438±00 minutos a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante, agregar medio de cultivo completo fresco, pasar a una botella de cultivo para continuar el cultivo y luego cambiar el medio cada 2 o 3 días hasta que las células estén llenas. Generaciones posteriores.
1.2.4 Identificación celular
1.2.4.1 Examen con microscopio invertido.
1.2.4.2 Examen inmunohistoquímico: se utilizó el método S-P para la tinción inmunohistoquímica de la actina del músculo liso.
1.2.4.3 Detección por transferencia Northern: Se pasaron células de la sexta a la octava generación de ratones transgénicos y ratones de control normales durante 72 horas y luego se cultivaron en medio DMEM que contenía 0,4 suero (mitad humano y mitad vaca). 48 h (permitir que las células se vuelvan confluentes). Se cultivaron cuatro botellas en cada grupo (75 cm2/botella) en medio DMEM que contenía 10 NCS durante 48 horas. Luego digerir con 0,01 de tripsina, recoger las células a 4 ° C, 1.000 r/min, 5 min y lavar el sedimento celular dos veces con 10 veces tampón PBS. Luego se extrajo el ARN total según el método de Chomczynski et al.[6]. Se sometieron a electroforesis 20 mg de ARN total en un gel desnaturalizante de agarosa-formaldehído 1,2 y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa.
Se utilizó el método del cebador aleatorio para marcar el fragmento psti de 2,2 kb de Apo AI humana como sonda para la detección por transferencia Northern.
2 resultados
2.1 Microscopio de contraste de fases
Hay células de músculo liso y células de músculo no liso en las células primarias, y las células de músculo liso se pasan a La quinta a sexta generación llega a más de 95. Se detectaron 99 células viables mediante tinción azul. Bajo el microscopio se pueden observar células adherentes en forma de husos o husos largos, y las células crecen de forma paralela o radial (Figura 1).
2.2 Examen inmunohistoquímico
Las células cultivadas se tiñeron con anticuerpo monoclonal de actina de músculo liso (método S-P), que mostró una reacción positiva (Figura 2).
2.3 Detección por transferencia Northern
Los resultados mostraron que el ARNm de apo AI se expresaba en células del músculo liso aórtico de ratones transgénicos pero no en ratones normales (Figura 3).
3 Discusión
El cultivo de VSMC proporciona un buen método experimental para estudiar la relación entre la proliferación y diferenciación de las células del músculo liso y la aterosclerosis. El cultivo de SMC aórticas de animales grandes generalmente adopta el método de digestión y adhesión enzimática [3, 4, 7]. Sin embargo, es difícil aislar y cultivar SMC aórticas de ratón y no hay informes en China. Este experimento mejoró el método del diafragma y aisló y cultivó con éxito células del músculo liso aórtico de ratón. La microscopía óptica y la inmunohistoquímica confirmaron células de músculo liso. La transferencia Northern mostró que el ARNm de apoAI se expresaba en células del músculo liso aórtico de ratones transgénicos, pero no en ratones normales (Fig. 3).
Debido al pequeño tamaño de los ejemplares de aorta de ratón, especialmente de ratones transgénicos, el coste es elevado y el suministro de materiales complicado. Las membranas interna y externa no se quitan fácilmente. La ventaja de tomar muestras arteriales después del lavado en este experimento es que la conexión entre la arteria y el corazón es relativamente fija, lo que facilita la eliminación de las membranas del lavado pancreático. Además, en el medio de cultivo, basándose en las características de baja gravedad específica de la adventicia y alta gravedad específica del músculo liso, la arteria se cortó en pequeños trozos de tejido celular y el tejido suspendido se lavó repetidamente con el medio de cultivo para eliminarlo. la adventicia. El método es simple y tiene una alta tasa de supervivencia. Las SMC cultivadas en este experimento procedían de ratones transgénicos y ARNm de apoAI humana altamente expresado. Esto proporciona un modelo celular ideal para estudiar más a fondo el papel de la expresión del gen apoAI en el metabolismo del colesterol y la aterosclerosis a nivel celular y molecular.