Métodos específicos para PCR de colonias

1. Preparar la mezcla de PCR de colonias (comúnmente conocida como mezcla de PCR)

Tapón Taq (10×) 180 ul

dNTP (2,5 mM) 20~ 25 ul

Primer Forward (concentración de cebador a 10 Pmol) 5 ul

Primer Reverse (concentración de cebador a 10 Pmol) 5 ul

ddH2O 720 ul

Taq (2U/ul) 12~15 ul

2. Seleccione aleatoriamente una sola colonia en la placa a temperatura ambiente y use un palillo esterilizado o la punta de una pipeta para seleccionar una sola colonia (énfasis en una). colonia única, no clon doble), copie una colonia única en la placa de agarosa LB y luego coloque el palillo o la punta de la pipeta teñida con bacterias en el tubo PCR8 correspondiente o en la placa de reacción de PCR de 96 pocillos (la placa de reacción de 96 pocillos y la seleccionada). colonia tiene buena Por ejemplo, si los puntos en la placa son 1#, 2#, 3#... entonces la placa de reacción vacía 96 también está marcada con 1#, 2#, 3#). (... para seleccionar clones después de la amplificación y el cultivo), y luego transferir las 96 colonias de clones individuales seleccionadas a un medio de cultivo en placa de 48 pocillos para su cultivo. Después de seleccionar las colonias de clones individuales para la transferencia, debido a la selección, las colonias tomadas se tiñen. en una placa de reacción de 96 pocillos. Los cebadores universales correspondientes se pueden mezclar con la mezcla de PCR preparada previamente y luego agregarse a la placa de reacción de 96 pocillos para la reacción.

3. Introducir la mezcla de PCR con bacterias en la máquina de PCR y amplificarla en condiciones normales.

4. Agregue azul de bromofenol u otros colorantes a la solución de reacción de amplificación y realice electroforesis para verificar si se obtiene el fragmento objetivo. Si es así, es un clon positivo.

5. Seleccione las cepas correspondientes a los clones positivos seleccionados en una placa de reacción de 96 pocillos, continúe cultivando a 37 grados durante un período de tiempo determinado para extraer el plásmido y secuenciar para verificar si es así. el gen objetivo requerido

Nota: El diseño del cebador es muy crítico. En términos generales, si se trata de clonación direccional, se puede utilizar el cebador universal en el vector; por ejemplo, la serie pET puede utilizar el cebador universal T7; Si se trata de clonación no direccional (como digestión con una sola enzima o ligadura de extremos romos), se debe usar un cebador en el vector y un cebador en el gen objetivo. Esto facilita la identificación y la probabilidad de. el error es muy bajo. La selección de las condiciones de la PCR es casi óptima. Al mismo tiempo, no es aconsejable seleccionar demasiadas cepas, de lo contrario se producirá una amplificación no específica.

La concentración de los cebadores utilizados no debe ser demasiado alta, ya que una concentración demasiado alta conducirá a una amplificación no específica, y el número de ciclos de reacción no debe ser demasiado, generalmente no más de 25 veces. . Al mismo tiempo, debido al contenido de GC de los fragmentos amplificados, algunos tienen un contenido de GC muy bajo y otros tienen un contenido de GC muy alto, lo que dificulta que la PCR de colonias amplifique la banda objetivo. Se recomienda configurar el programa de PCR. con una temperatura de GC alta como límite superior para cada ciclo se redujo aproximadamente 0,2 grados.

Placa de reacción de 96 pocillos