Determinación de benzo(a)pireno mediante cromatografía líquida de alta resolución
Las muestras de benzo[a]pireno en agua se extrajeron mediante extracción líquido-líquido con n-hexano, extracción en fase sólida, columna C18, elución con diclorometano y otros métodos. El extracto se purificó mediante una columna de gel de sílice, se concentró a un volumen constante, se separó y se detectó mediante cromatografía líquida de alta resolución-detector de fluorescencia UV en serie y se cuantificó mediante un método estándar externo.
Este método es adecuado para el análisis de benzo[a]pireno en aguas subterráneas, superficiales, potables y residuales, en los que la extracción en fase sólida es adecuada para el análisis de agua limpia. El límite de detección de este método depende de la sensibilidad del instrumento y de la matriz de la muestra. Cuando el volumen de muestreo es 1,0 L de agua limpia, el límite de detección de este método es 0,50 ng/L.
Instrumentos y Equipos
Cromatógrafo líquido de alta resolución con detector UV y detector de fluorescencia.
Dispositivo de extracción en fase sólida.
Evaporador rotativo.
Soplador de nitrógeno en baño maría a temperatura constante.
Oscilador.
Embudo de decantación de 1L con pistón de PTFE.
Utilice la columna C18 para extraer en fase sólida 1000 mg, 6 ml.
Columna de purificación de gel de sílice 1000mg, 6mL.
Columna analítica WastersPAHsC18 columna especial para cromatografía líquida, 250mm×4,6mm, tamaño de partícula 5 μm o columna de cromatografía líquida de similar rendimiento, 250mm×4,6mm, tamaño de partícula 5 μm.
Centrifugar.
Reactivos y materiales
El sulfato de sodio anhidro y el cloruro de sodio son puros de primer grado, se queman en un horno de alta temperatura a 600°C durante 4 horas y se colocan en un desecador durante uso posterior.
El N-hexano, el cloruro de metileno y la acetona son todos residuos agrícolas.
Metanol grado HPLC.
Estándar sustituto de terfenilo Pese el estándar sustituto de terfenilo sólido, disuélvalo en una solución de metanol y dilúyalo gradualmente con metanol hasta obtener una solución madre de 10,0 μg/ml. El estándar alternativo es 1-fluoronaftaleno 100,0 μg/ml, que es un material estándar certificado. Los estándares sustitutos se almacenaron a -18°C hasta su uso.
Benzo[a]pireno, solución madre estándar, almacenada en un lugar oscuro a -18°C, se compró en el Centro Nacional de Materiales de Referencia.
Botella muestra de 1L de color marrón.
El filtro de jeringa y el modelo de filtro de jeringa tienen un tamaño de poro de 0,45 μm, un diámetro de 4 mm y una membrana de filtro de PTFE.
Recogida y almacenamiento de muestras
Antes del muestreo, las botellas de muestreo no deben lavarse previamente con muestras de agua. La muestra debe llenar toda la botella de muestreo sin dejar burbujas de aire. Una vez que las muestras se hayan recolectado por completo, deben colocarse rápidamente en un refrigerador de baja temperatura y enviarse al laboratorio para su análisis lo antes posible. Después de llegar al laboratorio, las muestras deben transferirse a un refrigerador a 4°C para su almacenamiento lo antes posible. La extracción de la muestra se completa en un plazo de 7 días y las pruebas se completan en un plazo de 40 días. El benzo(a)pireno es sensible a la luz. Durante todo el proceso de recolección, transporte, almacenamiento y análisis de muestras, evite la luz tanto como sea posible para evitar la fotólisis.
Método de análisis
1) Extracción de muestras.
A. Extracción líquido-líquido. Vierta 1,0 l de muestra de agua en un embudo de decantación de 1 litro con 30 g de NaCl añadidos previamente. Después de disolver el NaCl, agregue 50 ml de n-hexano y 5 μl de solución estándar de reemplazo de p-terfenilo de 10,0 μg/ml. Enjuague la botella de muestra con 20 ml de acetona y eluya. la solución a un embudo de decantación y agitar durante 5 minutos. Deje reposar durante 10 a 20 minutos, transfiera la fase de agua a la botella de muestra original y transfiera la fase de n-hexano al matraz de fondo plano durante 10 a 20 minutos. La muestra original se extrajo por segunda vez. El método de extracción fue el mismo que la primera vez y la cantidad de n-hexano se redujo a 30 ml. Combinar las fases de n-hexano, añadir 3 g de sulfato de sodio anhidro, agitar suavemente y observar si hay aglomeración. Si hay grumos, agregue sulfato de sodio anhidro hasta que se vuelva arenoso, déjelo reposar durante 20 minutos, luego fíltrelo en otro matraz de fondo plano de 150 ml y use rotavapor para concentrar el filtrado a aproximadamente 3 ml. Si se trata de agua subterránea limpia, la muestra se puede transferir directamente a la botella de concentración de KD sin purificación, purgar con nitrógeno hasta 0,3 ml, agregar metanol hasta 0,5 ml, purgar con nitrógeno hasta 0,3 ml, agregar metanol hasta 0,50 ml y purgar con nitrógeno. a 0,3 ml y finalmente diluir el volumen con metanol a 1,0 ml, filtrar con un filtro de membrana de 0,45 μm y medir por HPLC.
Si la contaminación es grave, se requiere purificación. Para conocer los métodos de purificación, consulte 2) Purificación de muestras.
B. Extracción en fase sólida (aplicable a muestras de agua limpia). Coloque la columna C18 de extracción en fase sólida (1000 mg, 6 ml) en el dispositivo de extracción en fase sólida, lave la columna C18 con 10 ml de diclorometano y luego lave la columna C18 dos veces con 10 ml de metanol (la segunda vez es empapado en metanol durante 5 minutos). Durante la activación, no permita que la columna se drene. Se agregaron 5 g de cloruro de sodio, 40 ng de terfenilo estándar sustituto y 30 ml de metanol a una muestra de agua de 1,0 l para su enriquecimiento y luego la muestra pasó a través de la columna C18 activada a un caudal de 5 ml/min. Después de que la muestra se secó al vacío durante 3 minutos, se retiró la columna C18 y se centrifugó a 3000 rpm durante 10 minutos para eliminar el agua. Después de la deshidratación, vuelva a colocar la columna C18 en el dispositivo de extracción en fase sólida, sumérjala en 5 ml de cloruro de metileno durante 5 minutos y luego fluya hacia abajo de forma natural para recoger el eluato. Enjuague el vial con 4 ml de cloruro de metileno y mezcle con el eluyente de muestra. Agregue 1 g de Na2SO4 anhidro al eluato, agite bien y déjelo reposar durante 15 minutos. Utilice un gotero para transferir el eluato a una botella de concentración KD de 25 ml. Lave la fase de Na2SO4 con 2 ml de diclorometano, luego combínela en la botella de concentración KD. y agregar 0,5 ml de metanol, purgar con nitrógeno hasta 0,5 ml, luego agregar 1,0 ml de metanol, purgar con nitrógeno hasta 0,5 ml y finalmente ajustar a 655 ml con metanol.
2) Purificación de la muestra. Después de preactivar la columna de gel de sílice con 10 ml de solución de 10 acetona-hexano y 10 ml de n-hexano, cuando el n-hexano se acerque a la capa superior de gel de sílice, transfiera rápidamente el extracto de muestra a purificar a la columna, lave con 5 ml de n-hexano y desechar. Luego mezclar con 25 ml de n-hexano-diclorometano (1 1).
3) Curva de calibración. Se diluyó una solución estándar secundaria de benzo[a]pireno (1,93 μg/ml) con metanol y se preparó en 0 ng/ml, 1,93 ng/ml, 9,65 ng/ml, 1,93 ng/ml, 28,9 ng/ml y 38,6 ng/ml respectivamente. Serie estándar de .ml. Se establece una curva estándar a partir de las concentraciones y las áreas de los picos correspondientes.
4) Condiciones de análisis por cromatografía líquida de alta resolución. La fase móvil era una solución de metanol, el caudal fue de 1,2 ml/min (modo de flujo constante) y la temperatura de la columna fue de 40 °C. Detector UV: longitud de onda 254 nanómetros. Detector de fluorescencia (FLD): 0 ~ 6 minutos, longitud de onda de excitación (Ex) 250 nm, longitud de onda de emisión (Em) 370 nm; 6 ~ 15 minutos, longitud de onda de excitación 294 nm, longitud de onda de emisión 430 nm;
5) Análisis cualitativo y cuantitativo.
A. Análisis cualitativo. El análisis cualitativo se realiza comparando el tiempo de retención del objetivo a medir en la muestra con el tiempo de retención del objetivo estándar. El método de detección utiliza fluorescencia y detección en tándem ultravioleta. Especialmente cuando hay interferencias, los cromatogramas de fluorescencia y UV deben analizarse cuidadosamente para eliminar las interferencias. Si el contenido de la sustancia objetivo en la muestra alcanza más de 5 veces el límite de detección del método, es necesario confirmarlo mediante GC-MS.
B.Análisis cuantitativo. El análisis cuantitativo se realiza mediante fluorescencia y detección en serie UV. La detección de fluorescencia es el método principal, y si hay interferencia o no, se debe combinar con la detección ultravioleta para determinar de manera integral. Cuantificación por método estándar externo. Luego, la concentración en la muestra se calcula en función de la concentración de la muestra medida y el peso de la muestra. La estación de trabajo de HPLC puede completar automáticamente el área del pico y la curva de calibración cuantitativa del compuesto objetivo, y la curva de calibración cuantitativa también se puede completar con el software EXCEL. Para áreas de picos integradas automáticamente, la línea de base de cada pico debe verificarse una por una y las líneas de base no razonables deben corregirse si es necesario.
Para muestras cuyo contenido esté cerca del límite de detección, se puede utilizar una calibración estándar de un solo punto cercana a su concentración. Para muestras cuyo contenido excede el límite superior de la curva de calibración, el volumen de muestra debe diluirse o reducirse para mantener el área del pico dentro del rango lineal de la curva de calibración y volver a medirse.
6) Indicadores de desempeño del método.
Prepare soluciones de prueba en blanco de benzo[a]pireno y terfenilo con una concentración másica de 19,3 ng/L y 40 ng/L de terfenilo respectivamente, y analícelas de acuerdo con los pasos de análisis de la muestra. La precisión y la tasa de recuperación del método son 2,07 y 81,1. ~ 93,0 respectivamente. (n = 0,001)
La ecuación lineal de la curva estándar de benzo[a]pireno anterior es y=55947x-5570,5 y el coeficiente de correlación R2=0,9999.
Agregue un estándar de benzo[a]pireno con una masa de 3,86 ng a una muestra de agua en blanco de 1,0 l y utilice la misma muestra para el análisis. El límite de detección de este método es 65438±0,00 ng/L y la concentración equivale a 3 veces la relación señal-ruido.
Estudio de cromatograma (Figura 82.9):
Figura 82.9 Cromatograma HPLC estándar (detección de fluorescencia) de benzo[a]pireno
Gestión de calidad
Para cada lote de muestras o hasta 20 muestras, se debe realizar al menos un blanco de reactivo de proceso completo, una muestra doble paralela y un análisis de picos de matriz para monitorear el daño causado por el material de vidrio, reactivos, solventes y otro hardware durante el análisis. proceso Para garantizar la precisión de la interferencia y el análisis de la muestra relacionada, la concentración aumentada no deberá ser inferior a la concentración de fondo de la muestra original.
Cuando se analiza durante más de 8 horas o cada 10 muestras, se debe comprobar el estado de funcionamiento del instrumento utilizando el estándar de confirmación a una concentración media en la curva estándar. Cuando la desviación entre el estándar de confirmación y el estándar original excede 20, se debe volver a determinar la serie estándar. Si la desviación sigue siendo mayor que 20, es necesario preparar nuevamente la curva estándar y analizar la muestra.
La tasa de recuperación del terfenilo estándar alternativo (o 1-fluoronaftaleno) debe ser de 65 ~ 130; si no está dentro del límite, debe volver a verificar y confirmar el cálculo, reemplazar el estándar y el instrumento.
Cosas a tener en cuenta
El benzo(a)pireno es un carcinógeno fuerte, por lo que la concentración y purificación del extracto debe realizarse en una campana extractora y se deben usar máscaras antigás. si es necesario Máscaras y guantes para reducir el daño al cuerpo humano.