Detección de paso alto rápida y precisa de derivados que contienen IgG y Fc mediante el método de polarización de fluorescencia
Dra. Carolina Doherty
Nibert Valitacell, Blackrock Foster Avenue, Dublín, Irlanda
Se puede utilizar el lector de microplacas multifuncional BMG ¿Nueva tecnología para IgG cuantitativa Valita? Determinación de la concentración
Detección directa de IgG en sobrenadante de cultivo celular mediante el método de polarización de fluorescencia
Programa de detección de lector de microplacas preestablecido y plantilla de análisis de datos para mejorar la velocidad de la investigación
Introducción
La detección precisa, rápida y de paso alto de IgG es esencial para el desarrollo y la producción de la mayoría de los anticuerpos terapéuticos. Los anticuerpos monoclonales desempeñan un papel importante en el campo biofarmacéutico y una gran cantidad de muestras esperan una mayor detección y desarrollo. Aquí presentamos una nueva tecnología de detección para la cuantificación directa de IgG en sobrenadantes de cultivos celulares: ¿Valita? Potencia.
Las tecnologías existentes, incluida la cromatografía líquida de alto rendimiento de proteína A (proteína A HPLC), ELISA, el método de interferencia de superficie de proteína A y HTRF (fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo), tienen deficiencias obvias, incluido el alto precio. , trabajo y mucho tiempo.
¿Varita? El método del título es un nuevo método para detectar IgG, con alta precisión y bajo costo. El rango de detección es de 2,5 a 80 mg/L. Potency utiliza tecnología de polarización de fluorescencia para detectar la unión del fragmento Fc de IgG a la proteína G (Figura 1). El análisis se realiza en una placa de 96 pocillos, que es sencilla de operar, de alto rendimiento, rápida y automatizada. El ensayo se puede realizar en pequeñas cantidades de medios de cultivo celular sin procedimientos de preparación complejos.
En esta guía de aplicación, presentamos PHERAstar? , estrella POLAR? ¿Omega y CLARIOstar? ¿Se utiliza Valita en un lector de microplacas multifunción? Protocolo de detección cuantitativa de IgG mediante kits de titulación.
La polarización de fluorescencia puede analizar eficazmente los cambios en el tamaño molecular. Un fluoróforo "inmóvil" emitirá fluorescencia en la misma dirección de polarización que la luz de excitación cuando se excita con luz polarizada. Sin embargo, la dirección de polarización del fluoróforo giratorio cambia en cierta medida en comparación con la dirección de polarización de la luz de excitación. En solución, las moléculas pequeñas giran más rápido que las moléculas más grandes, por lo que los cambios en el tamaño de las moléculas unidas a grupos fluorescentes se pueden medir mediante el grado de despolarización de la fluorescencia. Por lo tanto, la proteína G marcada con fluorescencia gira más rápido y se despolariza más cuando no está unida a otras moléculas, mientras que ocurre lo contrario (5 veces más) cuando la proteína G se une a IgG (Figura 2). Este cambio de polarización se utiliza para detectar IgG en solución. La polarización de fluorescencia (FP) se logra iluminando una solución con luz de excitación de polarización paralela y midiendo la fluorescencia emitida en direcciones paralelas y perpendiculares. FP es la diferencia normalizada entre dos fluorescencias polarizadas, generalmente expresada como mP.
Materiales y Métodos
Varita? Kit de determinación de potencia
¿Varita? Software de aplicación de titulación (incluido en el kit)
Estándares de IgG (IgG derivada del suero humano)
Etiquetas enzimáticas multifunción PHERAstar, POLARstar Omega y CLARIOstar (BMG Laboratory Technologies Company)
Proceso experimental
La preparación de la muestra debe cumplir con los requisitos correspondientes de las instrucciones del kit. La curva estándar se dibuja de tal manera que cada valor de fluorescencia relativo corresponda a un estándar de IgG. ¿En Varta? ¿Agregar 60? Reconstruyo el buffer y 60? lEstándar o muestra. Después de mezclar, incubar en la oscuridad durante 30 minutos. Luego, lea en el lector de microplacas multifuncional POLARstar Omega, PHERAstar o CLARIOstar (BMG LABTECH) utilizando el programa de detección preestablecido (consulte la tabla siguiente para conocer la configuración de los parámetros). En el software de análisis MARS, los datos brutos obtenidos se convierten en un archivo. formato csv entonces Valita? Software APP para análisis.
Ajustes del instrumento
Resultados y discusión
¿Se utilizó Valita para la curva estándar (2,5-80 mg/L) en la Figura 3? En el lector de microplacas multifuncional de BMG LABTECH (POLARstar Omega, CLARIOstar, PHERAstar) con función de detección de polarización de fluorescencia. Kit de titulación. Los resultados obtenidos por todos los instrumentos de etiquetado de enzimas son muy estables.
Finalmente, utilizamos muestras cultivadas en diferentes condiciones y ¿Valita? Los resultados de la cuantificación del título de IgG se compararon con los de la HPLC convencional. La Figura 4 muestra la correlación entre los resultados de los dos métodos, lo que indica que ambos métodos cuantitativos tienen buena precisión, mientras que Valita? El análisis de títulos es más rápido porque no requiere una preparación compleja de la muestra.
Conclusión
En el desarrollo y producción de este biofarmacéutico, la determinación rápida de la concentración de IgG en muestras mixtas es muy importante. Aquí presentamos una nueva tecnología: ¿Valita? Para una determinación rápida y sencilla de derivados de IgG y Fc de paso alto basados en la polarización de fluorescencia. Análisis de potencia. ¿Valita? El método de análisis de títulos puede medir directamente la IgG en la muestra que se va a analizar sin un proceso complicado de preparación o purificación de la muestra. ¿Valita usa CLARIOstar, PHERAstar, POLARstar Omega? El análisis de potencia mostró un rendimiento excelente. En comparación con otras prácticas de cuantificación de IgG, Valita? El título es de alto rendimiento, simple, preciso y rápido.
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