¿Cuáles son los principales métodos de investigación de la ingeniería de proteínas?
La llamada ingeniería de proteínas consiste en transformar proteínas mediante ingeniería genética, incluida la mutación dirigida al sitio y la expresión genética, para obtener moléculas de proteínas con propiedades y funciones más completas.
La proteína es la encarnación de la vida. Sin proteínas la vida dejaría de existir. Sin embargo, algunas proteínas naturales presentes en los organismos suelen ser insatisfactorias y requieren modificación. La proteína está compuesta de muchos aminoácidos en un orden determinado. Cada proteína tiene su propia secuencia de aminoácidos única, por lo que cambiar los aminoácidos clave puede cambiar las propiedades de la proteína. Los aminoácidos están determinados por el código triplete. Cambiando una o dos bases que constituyen el código genético se puede lograr el propósito de modificar la proteína. Un enfoque importante del proyecto de proteínas es rediseñar el gen que codifica una determinada proteína en función de las necesidades de las personas, de modo que la proteína sintetizada sea más adecuada para las necesidades humanas. Esta tecnología, que modifica la estructura molecular de las proteínas provocando mutaciones dirigidas al sitio de una o varias bases, se denomina tecnología de mutagénesis dirigida al sitio de genes.
El Proyecto Proteína se desarrolló sobre la base de la tecnología de recombinación genética, la bioquímica, la biología molecular, la genética molecular y otras disciplinas, integrando cristalografía de proteínas, dinámica de proteínas, química de proteínas y diseño asistido por ordenador. Su contenido incluye principalmente dos aspectos: sintetizar proteínas con secuencias de aminoácidos específicas y estructuras espaciales según sea necesario; determinar la relación entre la composición química, la estructura espacial y las funciones biológicas de las proteínas. Sobre esta base, a partir de la secuencia de aminoácidos se puede predecir la estructura espacial y la función biológica de la proteína, y se puede diseñar y sintetizar una nueva proteína con funciones biológicas específicas. Este es también uno de los objetivos más fundamentales del proyecto de proteínas.
Actualmente no existe una definición unificada de ingeniería de proteínas. Generalmente se cree que la ingeniería de proteínas es la modificación o diseño y síntesis de proteínas con funciones biológicas específicas mediante tecnología de recombinación genética. De hecho, la planificación de proteínas incluye el aislamiento y purificación de proteínas, el análisis, diseño y predicción de la estructura y función de las proteínas, y la reconstrucción o creación de proteínas mediante recombinación genética u otros medios. A grandes rasgos, los proyectos proteicos son la transformación de proteínas o el diseño y síntesis de una nueva proteína con funciones específicas mediante técnicas de recombinación físicas, químicas, biológicas y genéticas.
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Enfoque básico de la ingeniería de proteínas
Comenzar desde la función esperada de la proteína → Diseñar la estructura esperada de la proteína → Inferir la secuencia de aminoácidos apropiada → Encuentre la secuencia de ribonucleótidos (ARN) correspondiente → encuentre la secuencia de desoxinucleótidos (ADN) correspondiente.
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El contenido principal de la investigación
Análisis de la estructura de las proteínas
Uno de los contenidos principales de la investigación El proyecto consiste en recopilar una gran cantidad de información sobre la estructura molecular de las proteínas, estableciendo así una base de datos de relaciones estructurales y funcionales, sentando las bases para la investigación teórica sobre la relación entre estructura y función en las proteínas. La determinación de la estructura tridimensional es un medio necesario para verificar las hipótesis de diseño de proteínas, es decir, para demostrar que la nueva estructura cambia la función biológica original. La tecnología de cristalografía ha logrado grandes avances en la determinación de la estructura de las proteínas, pero la deficiencia más obvia es la necesidad de separar una cantidad suficiente de proteína pura (de varios miligramos a decenas de miligramos) para preparar monocristales y luego realizar una recopilación de datos complejos. y análisis.
Además, el estado cristalizado de las proteínas difiere de su estado natural, y esto debe tenerse en cuenta durante el análisis. La RMN puede analizar la estructura de cadenas peptídicas en estado líquido. Este método evita las dificultades de la cristalización y el análisis de imágenes por difracción de rayos X y analiza directamente la estructura de las proteínas en su estado natural. La tecnología moderna de RMN ha evolucionado de unidimensional a tridimensional. Con la ayuda de ordenadores, se pueden analizar de forma eficaz y simular directamente la estructura espacial de las proteínas, la unión de las proteínas a grupos y sustratos auxiliares y el mecanismo cinético de la catálisis enzimática. En cierto sentido, la RMN puede analizar mutaciones en proteínas de manera más eficiente. Muchas instituciones de investigación extranjeras están trabajando en la combinación de proteínas y ácidos nucleicos, en el desarrollo de inhibidores de enzimas y proteínas.
Proteína farmacéutica altamente específica.
Diseño y predicción de estructura y función
Basado en los datos de la base de datos establecida mediante el análisis de la estructura y función de proteínas naturales, la estructura espacial y la cadena peptídica de un determinado aminoácido. La secuencia se puede predecir. Por el contrario, la secuencia de aminoácidos y la estructura espacial de las proteínas pueden diseñarse según funciones biológicas específicas. La relación entre estructura y función se puede investigar y analizar directamente mediante experimentos como la recombinación genética. También podemos analizar y calcular la estructura tridimensional y las funciones biológicas de las moléculas de proteínas a través de principios básicos como la dinámica molecular y la termodinámica molecular, como la energía más baja y el hecho de que dos átomos no pueden existir en la misma posición al mismo tiempo. Aunque el trabajo en esta área está todavía en sus inicios, es previsible que en el futuro se pueda establecer un conjunto completo de teorías para explicar la relación entre estructura y función, diseñando y prediciendo así la estructura y función de las proteínas.
Creación y Transformación
Existen muchas formas de modificar proteínas, que van desde simples métodos físicos y químicos hasta complejas recombinaciones genéticas. Métodos físicos y químicos: desnaturalización y renaturalización de proteínas, modificación de grupos funcionales de cadenas laterales de proteínas, segmentación de cadenas peptídicas, cambios en la distribución de carga superficial para promover la formación de una determinada imagen tridimensional de la proteína, etc. Método bioquímico: utilice proteasas para dividir selectivamente proteínas, utilice transglicosidasas, esterasas, aciltransferasas, etc. Eliminar o unir diferentes grupos químicos, utilizar transglicosidasas para unir proteínas, etc. Los métodos anteriores solo pueden actuar sobre grupos o enlaces químicos iguales o similares, carecen de especificidad y no pueden actuar sobre partes específicas. Utilizando tecnología de recombinación genética o ADN sintético, no sólo se pueden transformar proteínas, sino que también se puede sintetizar una nueva proteína desde cero.
Las proteínas están compuestas por diferentes aminoácidos conectados en un orden determinado mediante enlaces peptídicos. La secuencia de aminoácidos es la estructura primaria de una proteína y determina su estructura espacial y función biológica. La secuencia de aminoácidos está determinada por la secuencia de ADN del gen que sintetiza la proteína. Cambiar la secuencia del ADN puede cambiar la secuencia de aminoácidos de la proteína y lograr una biosíntesis controlable de la proteína. Antes de determinar la relación entre la secuencia genética o la secuencia de aminoácidos y la función de la proteína, se utilizan mutaciones aleatorias para provocar la eliminación, inserción o sustitución de pares de bases, de modo que el objetivo de la investigación pueda limitarse a una determinada región, acortando así en gran medida la duración de análisis genético. Una vez que el ADN objetivo está claro, se puede estudiar utilizando técnicas como la mutagénesis dirigida.
Los aminoácidos en la proteína mutágena dirigida al sitio están determinados por el código triple en el gen. Siempre que se cambien uno o dos de ellos, el aminoácido se puede cambiar. La estructura, estabilidad o propiedades catalíticas de las proteínas generalmente se estudian cambiando el aminoácido en una posición determinada. El ciclo de vida del bacteriófago M13 tiene dos etapas. En la partícula del fago, su genoma es monocatenario y, después de invadir la célula huésped, existe en forma bicatenaria mediante replicación. Insertar el gen a estudiar en el vector M13 para formar una plantilla monocatenaria, sintetizar un oligonucleótido (que contiene una o varias bases desapareadas) como cebador, sintetizar la hebra complementaria correspondiente y conectarla a una doble hebra de bucle cerrado mediante Ligasa T4 molecular. Después de la transfección en E. coli, la molécula de doble cadena se replica en la célula, por lo que se obtienen dos tipos de placas: aquellas con bases no coincidentes son mutantes. Luego transfiéralo a un sistema de expresión adecuado para sintetizar la proteína mutante.
Mutagénesis en casete 1985 Wells propuso una tecnología de modificación genética: la mutagénesis en casete, que puede producir 20 mutantes de aminoácidos diferentes en un sitio a la vez y puede analizar la composición de aminoácidos importantes en las moléculas de proteínas "Saturación". ". Mediante mutagénesis dirigida al sitio, se modifican los dos vectores originales y los puntos de corte de la endonucleasa que no están presentes en el gen en ambos lados del código de aminoácidos. El gen se digiere con esta endonucleasa y luego se reemplaza con fragmentos sintéticos de ADN bicatenario. con diferentes cambios. La parte digestiva. De esta forma, se pueden obtener múltiples genes mutantes en un solo tratamiento.
Tecnología PCR La reacción en cadena de la ADN polimerasa es la tecnología de amplificación de genes más utilizada. Utilizando el gen en estudio como plantilla y oligonucleótidos sintéticos (que contienen una o varias bases no complementarias) como cebadores, se generarán genes mutantes mediante reacciones directas de amplificación de genes. Una vez aislado el gen mutante, la proteína mutante se sintetiza en un sistema de expresión adecuado. El método es directo, rápido y eficaz.
El uso de tecnología de alta tasa de mutación para detectar mutantes de una gran cantidad de orígenes naturales es una tarea que requiere mucho tiempo y mano de obra.
Hay dos nuevos métodos de mutación con altas tasas de mutación: ① Método de sulfonación negativa: después de que el oxígeno del grupo fosforilo entre los nucleótidos se reemplaza por azufre, la sustancia modificada (α-(s)-dctp) es resistente a ciertas endonucleasas sexualmente. la cadena negativa se sintetiza en presencia de cebadores y (α-(s)-dctp) y luego se trata con una endonucleasa para crear sólo una "mella" en la cadena positiva, utilizando exonucleotidasa III. ②Método de cadena positiva UMP: la cepa mutante de E. coli RZ1032 carece de uracilo glicosidasa y UTPasa, y M13 puede usar uracilo (U) en lugar de timina (T) para incorporarse a la plantilla sin modificaciones. El dúplex mutante generado a partir de este molde que contiene U se transformó en E. coli normal. Como resultado, el huésped degrada la cadena positiva que contiene U, mientras que la cadena negativa mutante se retiene y replica.
La fusión de proteínas consiste en trasplantar algunos genes que codifican una proteína a otro gen proteico o una combinación de fragmentos de diferentes genes proteicos. Una vez clonado y expresado el gen, se produce una nueva proteína de fusión. Este método puede centrar las propiedades de diferentes proteínas en una proteína y cambiar significativamente las propiedades de la proteína. Los llamados "anticuerpos quiméricos" y "anticuerpos populares" que más se han estudiado utilizan ahora este método.
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Aplicación práctica
Mejora la estabilidad de las proteínas.
La glucosa isomerasa (GI) se utiliza ampliamente en la industria. Para mejorar su estabilidad térmica, Zhu et al. determinaron la glicina en la posición 138 (Gly138) como el aminoácido objetivo y utilizaron un método de doble cebador para realizar una mutación dirigida al sitio in vitro del gen GI, reemplazando Gly138 con prolina. (Pro138), incluida la recombinación del mutante. La temperatura de reacción óptima aumentó en 65438±00 ~ 65438±02℃; la enzima tuvo la misma actividad específica. Según el análisis, la sustitución de Gly138 por Pro puede deberse a la introducción de un anillo de pirrol, que puede llenar la cavidad cerca de Gly138, haciendo que la estructura espacial de la proteína sea más rígida, mejorando así la estabilidad térmica de la enzima.
Proteína de fusión
La estructura lineal del péptido N-terminal 5 de la encefalina (ENK) es la región funcional básica que se une a los receptores δ del interferón (IFN). Citocinas de espectro antiviral y antitumoral. Li et al. sintetizaron químicamente la región codificante del péptido 5-terminal de EnkN, la conectaron al gen IFN α1 humano conectando la región codificante del péptido 3-terminal y expresaron la proteína de fusión en E. coli. Utilizando células de adenocarcinoma de colon humano y células de glioblastoma multiforme como modelos in vitro, se confirmó mediante la incorporación de 3H-timidina que la actividad inhibidora de la proteína de fusión era significativamente mayor que la del IFN solo. Los experimentos de bloqueo competitivo de naloxona demostraron que la mejora de la actividad inhibidora estaba realmente mediada por la zona dirigida por encefalina.
Cambios en la actividad de las proteínas
Por lo general, el contenido de insulina en la sangre humana alcanza un pico entre 30 y 60 minutos después de una comida y vuelve al nivel básico entre 120 y 180 minutos. Sin embargo, las preparaciones de insulina que se utilizan actualmente clínicamente sólo alcanzan el valor máximo 1,20 minutos después de la inyección y duran entre 1,80 y 240 minutos, lo que es incompatible con las condiciones fisiológicas humanas. Los experimentos muestran que la insulina existe en forma de dímero en concentraciones altas (más de 10-5 mol/L), y existe principalmente en forma de monómero en concentraciones bajas (menos de 10-9 mol/L). La insulina de acción rápida está diseñada para evitar que la insulina forme polímeros. La estructura y propiedades del factor de crecimiento similar a la insulina I (IGF-I) son altamente homólogas y similares en estructura tridimensional a la insulina, pero el IGF-I no forma dímeros. La secuencia de aminoácidos de B28-B29 en el dominio B de IGF-I (correspondiente a la cadena B de insulina) es opuesta a B28-B29 en la cadena B de insulina. Por lo tanto, la cadena B de insulina se cambió a B28Lys-B29Pro para obtener insulina monomérica de acción rápida. La insulina de acción rápida pasa los ensayos clínicos.
Modificación de enzimas terapéuticas contra el cáncer
La terapia génica contra el cáncer se divide en dos aspectos: los fármacos actúan sobre las células cancerosas para inhibir o matar específicamente las células cancerosas; los fármacos protegen las células normales del daño químico; Los medicamentos pueden aumentar la dosis de quimioterapia. La timina quinasa (TK) del herpesvirus cataliza la fosforilación de la timina y otros análogos estructurales como el ganciclovir y el aciclovir.
El ganciclovir y el aciclovir carecen del grupo hidroxilo terminal 3', que puede interrumpir la síntesis de ADN y matar las células cancerosas. La capacidad de HSV-TK para catalizar ganciclovir y aciclovir se puede mejorar mediante mutaciones genéticas. Se seleccionó una entre una gran cantidad de mutaciones aleatorias y se reemplazaron seis aminoácidos cerca del sitio activo de la enzima. La capacidad catalítica aumentó 43 veces y 20 veces, respectivamente. La O6-alquilguanina es el principal mutágeno y citotoxina que se forma después de que el ADN se trata con agentes alquilantes (incluidos los fármacos nitrosos utilizados en quimioterapia), por lo que las dosis de estos fármacos nitrosos son limitadas. O6-alquilguanina-ADN alquiltransferasa La O6-alquilguanina-ADN alquiltransferasa (AGT) puede eliminar el grupo alquilo de la guanina O6 y desempeñar un papel protector. Mediante transfección retroviral, la AGT humana se expresó en células de la médula ósea de ratón y ejerció un efecto protector. Mediante el tratamiento de mutagénesis, se obtuvieron algunos genes AGT mutantes positivos y su actividad fue mayor que la del tipo salvaje. Se descubrió que la prolina en la posición 139 de un gen mutado fue reemplazada por alanina.
Anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados
Las inmunoglobulinas tienen forma de Y y constan de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras unidas por enlaces disulfuro. Cada cadena se puede dividir en una región variable (terminal N) y una región constante (terminal C). El sitio de adsorción del antígeno está en la región variable y el sitio de adsorción de citotoxinas u otros factores funcionales está en la región constante. Cada región variable tiene tres partes de secuencias de aminoácidos altamente variables. La estructura tridimensional es la estructura suelta del extremo β (CDR), que es el sitio de unión del antígeno, y el resto es la estructura de soporte del antígeno. CDR. Las estructuras de las CDR se conservan en todas las especies, por lo que los anticuerpos se pueden modificar mediante ingeniería de proteínas.
Los anticuerpos monoclonales de ratón son rechazados por el sistema inmunológico humano y sus posibles efectos terapéuticos quedan desaprovechados. Los anticuerpos quiméricos se elaboran reemplazando la región constante de un anticuerpo monoclonal de ratón con la región constante de un anticuerpo humano, por lo que su inmunogenicidad se reduce significativamente. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal MAB 17-1A se utiliza para tratar el cáncer colorrectal. Aunque los anticuerpos quiméricos todavía tienen problemas de inmunogenicidad, varios anticuerpos quiméricos han pasado ensayos clínicos. El llamado anticuerpo humanizado consiste en injertar la región de adsorción del antígeno en el anticuerpo humano para minimizar la cadena peptídica extraña en el anticuerpo y minimizar la inmunogenicidad. Sin embargo, sólo cuando las CDR se transfieren a anticuerpos humanos, la cantidad de antígeno adsorbido es muy pequeña y se necesitan varios residuos de aminoácidos estructurales para mantener la capacidad de adsorción original. Por tanto, la inmunogenicidad y la adsorción de antígenos son contradictorias. Mediante el reemplazo de aminoácidos uno por uno o el análisis de simulación por computadora, la inmunogenicidad se puede reducir tanto como sea posible manteniendo la capacidad de adsorción original. Campath-1H es el primer anticuerpo popular utilizado clínicamente para tratar la enfermedad linfogranulomatosa y la artritis reumatoide. La eficacia es obvia, pero más de la mitad de los pacientes todavía tienen respuestas inmunes. Sin embargo, la respuesta inmune a otros anticuerpos comúnmente utilizados, como el anticuerpo anti-CD33 utilizado para tratar la leucemia mieloide, fue insignificante.
Avances en Ingeniería de Proteínas
Actualmente los proyectos de proteínas son proyectos moleculares que se están desarrollando mejor y más rápido. Esto se debe a que, después del diseño de las moléculas de proteínas, se puede aplicar ingeniería genética eficiente a la síntesis de proteínas. La primera ingeniería de proteínas fue la modificación molecular de la tiral-T-ARN sintetasa realizada por Forsht durante 1982-1985. Determinó la estructura del sitio de unión entre la enzima y el sustrato basándose en XRD (difracción de rayos X), cambió los residuos de aminoácidos unidos al sustrato mediante tecnología de mutación dirigida al sitio y midió la actividad de la enzima mutante resultante mediante métodos cinéticos y llevó a cabo discusiones en profundidad sobre el mecanismo de interacción entre enzima y sustrato. Perry cambió Ile(3) en la lisozima a Cys(3) en 1984, y la oxidó aún más para formar un enlace disulfuro Cys(3)-Cys(97), que mejoró la estabilidad térmica de la enzima y mejoró significativamente la eficiencia de la enzima. Valor de aplicación de la enzima a la industria alimentaria. En 1987, Forsht cambió Asp(99) y Glu(156) en la superficie de la molécula de subtilisina a Lys, lo que resultó en una disminución en el protón pKa de His(64) de 7 a 6 y un aumento de 10 veces en la actividad enzimática. a pH = 6. . El cambio en el valor de pH óptimo de las enzimas industriales demuestra que puede aportar enormes beneficios económicos. La ingeniería de proteínas también puede alterar la actividad catalítica de las enzimas, la especificidad del sustrato, las propiedades antioxidantes, la desnaturalización térmica y la desnaturalización alcalina. Esto muestra el poderoso y brillante futuro de la ingeniería de proteínas.
El ejemplo anterior es un enfoque de ingeniería de proteínas mediante sustitución y eliminación de residuos de aminoácidos clave. El otro es el típico enfoque de "diseño desde cero". DuPont anunció en 1988 que había diseñado y sintetizado con éxito 73 residuos de aminoácidos compuestos por cuatro hélices α antiparalelas. Esto demuestra que, de acuerdo con las necesidades esperadas de las personas, el objetivo de plegarse en nuevas proteínas mediante un diseño de novo está a la vista y al alcance de la mano. Los métodos modelo para predecir estructuras han desempeñado un papel importante a la hora de sentar las bases de la biología molecular. Cada vez está más claro que la estructura primaria de las proteínas contiene información sobre estructuras de orden superior. La predicción de estructuras de alto nivel mediante ingeniería molecular se ha convertido en un problema convincente junto con los enfoques de modelización.
El Proyecto Proteína reúne los últimos resultados de algunas de las áreas de vanguardia de la biología molecular contemporánea y otras disciplinas. Combina ácidos nucleicos y proteínas, y combina la estructura espacial y las funciones biológicas de las proteínas. El Proyecto Proteínas ha impulsado la investigación de proteínas y enzimas hacia una nueva era, abriendo perspectivas atractivas para sus aplicaciones en la industria, la agricultura y la medicina. El Proyecto Proteína marcó el comienzo de una nueva era de ingeniería y creación de proteínas para las necesidades humanas de acuerdo con los deseos humanos.
Las perspectivas de la ingeniería de proteínas
El progreso de los proyectos de proteínas presenta perspectivas atractivas para las personas. Por ejemplo, los científicos han convertido la insulina en un fármaco de acción rápida. Hoy en día, los científicos biológicos y de materiales están explorando activamente la aplicación de la ingeniería de proteínas en la microelectrónica. Los componentes electrónicos fabricados mediante métodos de ingeniería de proteínas tienen las características de tamaño pequeño, bajo consumo de energía y alta eficiencia, por lo que tienen perspectivas de desarrollo muy amplias.