¿A qué debemos prestar atención al inyectar células cancerosas por vía subcutánea en ratones desnudos?

No todas las células tumorales pueden convertirse en tumores. Se recomienda verificar los datos de prueba en ATCC antes del experimento formal. Por ejemplo, mire el cuadro rojo a continuación. Sin embargo, la ATCC carece de información en esta área, por lo que el segundo método es consultar la literatura. Sin embargo, aún se recomienda consultar más la documentación.

Si debe utilizar líneas celulares que no pueden formar tumores de forma independiente o que son difíciles de formar tumores, consulte el punto 3 Ratones NOD SCID y el punto 4 Método Matrigel.

2. ¿Cuál es tu número de teléfono móvil?

Es difícil tener un valor de referencia estándar para esto. Por ejemplo, experimenté con un glioma de ratón C6 muy agresivo que podía crecer incluso si el número de células era 10 4 o incluso menor. Sin embargo, la mayoría de las líneas celulares se ubicarán entre 10 y 10. A veces, si estás bajo, no significa necesariamente que no crecerás, sino que crecerás lentamente. Crecer más alto no es necesariamente mejor, pero crecer demasiado rápido puede provocar una mala formación de vasos sanguíneos en el tumor, lo que facilita la muerte. Además, si el fármaco se inyecta por vía intraperitoneal o intravenosa, no es fácil transportarlo por completo a la lesión tumoral.

Básicamente, podemos tener la experiencia de que la cantidad de células inyectadas puede hacer que el tumor crezca hasta un tamaño anatómico en 3-6 semanas. Lo rápido no es necesariamente mejor, lo lento es una pérdida de tiempo.

3. Selección de ratones

Básicamente, todos eligen ratones desnudos BALB/c con deficiencia de timo, que pueden satisfacer la mayoría de los experimentos. Para algunos tumores inmunosensibles, se puede seleccionar NOD SCID. Sin embargo, NOD SCID es peludo y algunas inyecciones o cirugías especiales para tumores requieren preparación de la piel.

En general, los tumores se pueden inyectar en ratones de 4 a 6 semanas de edad.

4. Cómo manejar las celdas

Definitivamente tomará mucho tiempo ir de la sala de celdas a la sala de animales. Cuando las células se dejan en el entorno de cultivo durante mucho tiempo, su actividad disminuirá, lo que provocará un fracaso experimental.

Aquí recomiendo obtener pellets celulares mediante lavado, digestión, centrifugación, etc., y luego suspenderlos en un tampón que pueda mantener la viabilidad celular. La composición del buffer es: agregar HEPES con una concentración final de 10-15 mM y GlutaMAX con una concentración final de 1X en HBSS sin Ca2+ y Mg2+. Tenga en cuenta que no agregue suero.

La concentración celular de cada aguja debe ajustarse a 100-200 μl. Por ejemplo, si la cantidad de células que desea inyectar es 10 6, ajuste la concentración de la suspensión celular a 100-200 ul. Es difícil alcanzar altas concentraciones para algunas células y requieren un mayor volumen de resuspensión. Personalmente, creo que es mejor no exceder los 300 ul por inyección, de lo contrario se escapará fácilmente durante la inyección.

Una vez resuspendidas las células, introdúzcalas en hielo y reserve.

Aunque algunas células tengan nódulos, es difícil o incluso imposible que se conviertan en tumores. En este momento, puede probar el método Matrigel para proporcionar un andamio de crecimiento para las células tumorales.

Normalmente, utilizamos Matrigel sin rojo de fenol reducido y con bajo factor de crecimiento, y la concentración de proteína aproximada será de alrededor de 10 mg/ml. Matrigel finalmente se mezclará 1:1 con la suspensión celular y se inyectará.

Tenga en cuenta dos puntos:

1. Matrigel se solidificará cuando la temperatura sea alta, por lo que se debe operar en hielo cuando se use. La suspensión también debe enfriarse en hielo antes de agregarla. Alternativamente, Matrigel se puede diluir 1:1 con la solución tampón anterior y usarse para resuspender el sedimento celular. Las suspensiones celulares que contienen Matrigel siempre deben mantenerse en hielo.

2. También debido al problema de la temperatura, es necesario inyectar uno y aspirar la suspensión durante la inyección. Además, prepare algunas jeringas adicionales para poder reemplazarlas si se obstruyen.

5. Método de inyección

Para reducir el dolor de los animales, usaré isoflurano (isoflurano) como anestésico por inhalación para anestesiar ligeramente a los ratones y luego realizaré la inyección. La siguiente imagen muestra el equipo de anestesia: a la derecha está el equipo para inyectar isoflurano. Aprovechando la volatilidad de la anestesia, bombee el gas anestésico a la caja sellada de la izquierda ajustando la válvula de presión de aire. Generalmente, los ratones pueden anestesiarse en 5 minutos y pueden mantener la anestesia durante aproximadamente 10 a 15 minutos.

Por supuesto que se puede inyectar directamente sin anestesia (sin infracción). Pero desde la perspectiva del bienestar animal y la conveniencia para el experimentador, la anestesia es mejor que ninguna anestesia. En la actualidad, el protocolo estándar para experimentos de trasplante de tumores subcutáneos en nuestra institución es la anestesia por inhalación. Pero esto no se hace muy bien en China y no existe una organización unificada para gestionarlo.

Atención, utilice los anestésicos de forma racional. La anestesia por inhalación de isoflurano es adecuada para la inyección subcutánea y tiene riesgos relativamente bajos (está incluida como sustancia controlada de la Lista VI en los Estados Unidos o no es una sustancia controlada clásica). No es necesario utilizar anestésicos inyectables como ketamina/xilazina, que son sustancias controladas y no deben usarse si no se trata de una cirugía mayor. No se deben utilizar fenobarbital ni otras inyecciones, ya que pueden afectar la actividad de las células tumorales.

Si no tienes un vaporizador de isoflurano, puedes fabricar tú mismo un dispositivo sencillo. Como se muestra en la imagen a continuación, en un frasco sellado, coloque algodón que contenga isoflurano diluido y coloque en él los animales de experimentación. La dosis de anestésico se convirtió de isoflurano en relación con el volumen del recipiente sellado.

Después de que el ratón caiga, usa un puñetazo para marcar las orejas (0/0, 1, 0/1, 1/1, * * *). Luego, use unas pinzas romas con una mano para levantar suavemente la piel en el lugar de la inyección sin tirar del músculo. Por otro lado, una jeringa de mano (normalmente una pequeña jeringa de insulina) perfora la piel e inyecta una suspensión celular. Durante el proceso de inyección, se puede ver claramente una pequeña bolsa que sobresale debajo de la piel. Después de la inyección, deje la aguja puesta unos segundos antes de sacarla. No lo saque inmediatamente para evitar fugas de suspensión celular.

Si no hay anestesia, el ratón sólo se puede coger con la mano. Si es diestro, use el dedo índice y el pulgar de la mano izquierda para pellizcar la piel del cuello del mouse y pellizque la cola entre el dedo meñique y el anular para que los lados del mouse queden expuestos cuando gire el mouse. mano izquierda. Luego sostenga la aguja en su mano derecha y péguela en la piel (la inspección visual mantendrá un ángulo de 10 a 20 grados con la piel) para insertar la aguja. Tenga en cuenta que cuando se haya perforado la aguja, mantenga la aguja ligeramente hacia arriba para evitar perforar el músculo. Vale la pena señalar que las ratas tendrán dificultades, así que mantén la mano firme. (Por lo tanto, es muy conveniente inyectar después de la anestesia)

En términos generales, si el volumen de inyección es solo de 100 a 200 ul, no habrá accidentes en esta operación. Pero si el volumen de inyección es grande, será más problemático. Sin embargo, según mi hermana mayor, después de perforar la piel, puedes continuar hasta los músculos superficiales, luego levantarlo, devolverlo a la capa subcutánea y comenzar a inyectar. De esta manera, es menos probable que se escapen grandes volúmenes de suspensión celular. Sin embargo, este método tiene una desventaja, que es que los tumores tienden a crecer profundamente en los músculos, por lo que la medición del volumen en ese momento no era precisa. Por tanto, el volumen de inyección debe ser lo más pequeño posible.

Después de la inyección, los ratones fueron devueltos a la jaula y se observó su vitalidad. Cuando los ratones estén completamente despiertos, podrán abandonar la habitación de los animales.