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⒈¿Cuál es el impacto del sistema tampón de gel en la electroforesis?

En la electroforesis discontinua SDS-PAGE, el tampón de preparación del gel utiliza el sistema tampón Tris-HCL, el pH del gel de apilamiento es 6,7 y el pH del gel de separación es 8,9; En el gel concentrado, el entorno de pH es débilmente ácido, por lo que la glicina se disocia muy poco y la eficiencia de natación bajo la acción del campo eléctrico es baja, mientras que el contenido de iones CL es muy alto, se forma una zona de baja conductividad entre los dos; y las moléculas de proteína se mueven entre los dos nadando. Dado que la conductividad es inversamente proporcional a la intensidad del campo eléctrico, el gradiente de voltaje que se forma en esta zona es mayor y las moléculas de proteína con mayor presión se juntan y se condensan en una zona estrecha. Cuando la muestra ingresa al gel de separación, debido a que el valor del pH en el gel aumenta y se vuelve alcalino, la glicina se disocia en grandes cantidades, acelera su velocidad de nado y, al mismo tiempo, sigue directamente a los iones de cloruro, debido al estrechamiento del gel. Tamaño de poro del gel de separación, bajo la influencia del campo eléctrico. Bajo la acción, las moléculas de proteínas se separan según sus propiedades de carga inherentes y su tamaño molecular.

Por lo tanto, la influencia del valor del pH en todo el sistema de reacción es crucial en el experimento, el problema no se puede resolver bien incluso si se excluyen otros factores. Por supuesto, otros factores deben considerarse primero. También se pueden utilizar factores.

¿Cómo manejar las muestras?

Dependiendo del propósito de la separación de la muestra, existen tres métodos de tratamiento principales: tratamiento reductor con SDS, tratamiento con SDS no reductor y tratamiento reductor con SDS más alquilación.

1) Reducción del tratamiento con SDS: Después de añadir SDS y DTT (o β-mercaptoetanol) al tampón de muestra, la conformación de la proteína se disocia, la carga se neutraliza y se forma una molécula que combina SDS y proteína. Durante la electroforesis Separe únicamente por peso molecular. Generalmente, la electroforesis se maneja de la siguiente manera: diluir la muestra a una concentración adecuada, agregarla al tampón de carga, centrifugar, hervir en agua hirviendo durante 5 minutos y luego centrifugar para agregar la muestra.

2) Tratamiento SDS de reducción de alquilación: la alquilación de yodoacetato de amina puede proteger bien y firmemente los grupos SH durante mucho tiempo y obtener bandas más estrechas. Además, el yodoacetato de amina puede interceptar el exceso de DTT y previene el fenómeno de textura de; tinción de plata.

3) Tratamiento con SDS no reductor: diluir la muestra hasta una concentración adecuada, añadirla al tampón de muestra, hervir con agua hirviendo durante 5 minutos y luego centrifugar para añadir la muestra. >3) Tratamiento con SDS no reductor: Los fluidos fisiológicos, suero, urea y otras muestras generalmente se hierven con solo 1% de SDS en agua durante 3 minutos sin agregar un agente reductor, de modo que el plegamiento de proteínas no se destruya y no pueda usarse para fines moleculares. determinación del peso.

3. ¿Cuáles son las funciones de los componentes principales del gel de electroforesis SDS-PAGE?

El papel de la poliacrilamida: La acrilamida también proporciona un vehículo para la electroforesis de proteínas. Su coagulación está directamente relacionada con el éxito o el fracaso de la electroforesis y está estrechamente relacionada con el acelerador de la coagulación y el medio ambiente;

Tampón de gel: elija pH 6,8 para concentración de gel, pH 8,8 para gel de separación, elija el sistema Tris-HCl, TEMED coopera con el catalizador AP para catalizar la polimerización de mono y dipropileno en poliacrilamida. TEMED tetrametiletilendiamina, catalizador, acelera el efecto catalítico del AP; dodecilsulfato de sodio (SDS): detergente aniónico, tiene cuatro funciones: descargar proteínas, disociar enlaces de hidrógeno entre proteínas y cancelar proteínas. La interacción hidrofóbica dentro de la molécula hace que el polipéptido se desplegue.

¿Cuál es el método para mejorar la resolución de la electroforesis SDS-PAGE?

La polimerización completa de la poliacrilamida puede mejorar la resolución del gel. Práctica recomendada: Después de que el gel se haya solidificado a temperatura ambiente, se puede dejar a temperatura ambiente durante un período de tiempo antes de su uso. Evite el uso o almacenamiento inmediato en un refrigerador a 4 °C, ya que el primero puede provocar fácilmente una solidificación insuficiente del gel y el segundo puede provocar fácilmente la cristalización de SDS. Generalmente, los geles se pueden almacenar a temperatura ambiente durante 4 días y el SDS puede hidrolizar la poliacrilamida.

¿Ten cuidado con la causa de la banda en forma de "cara sonriente" (lados hacia arriba y cóncava en el medio)?

Se produce principalmente por una solidificación desigual en la parte media del gel, que es más común en geles más espesos.

Método de procesamiento: Esperar hasta que se solidifique por completo antes de realizar experimentos posteriores.

¿Por qué elegiste la banda con forma de "fruncido el ceño" (ambos lados sobresalen en el medio)?

Principalmente en el tanque de electroforesis vertical de proteínas, las burbujas de aire en el espacio entre los fondos de las dos placas generalmente no se eliminan por completo.

Método de elaboración: Añadir una cantidad adecuada de tampón entre las dos placas para eliminar las burbujas de aire.

¿Por qué se produce el arrastre?

Se produce principalmente por una mala fusión de la muestra o una concentración excesiva del gel de separación. Además, puede ser que haya demasiado gel de separación durante el llenado del gel, lo que da como resultado muy poco gel de condensación, lo que no puede lograr la función de concentración y no presiona la muestra en una línea.

Método de procesamiento: centrifugar antes de agregar la muestra; elegir un tampón de muestra adecuado y agregar una cantidad adecuada de disolvente de muestra; si el tampón de electroforesis es demasiado largo, prepárelo nuevamente; No separe demasiado el gel al llenar el concentrado de gel.

¿Por qué las tiras aparecen texturizadas?

Provocada principalmente por partículas insolubles en la muestra.

Método de procesamiento: Centrifugar antes de agregar la muestra; agregar una cantidad adecuada de solvente antes de agregar la muestra.

¿Qué es la "cinta fantasma" y cómo tratarla?

La "banda fantasma" se refiere a moléculas de proteínas macromoleculares con conformaciones complejas durante la carrera. A menudo aparecen como bandas desconocidas de macromoléculas en la parte superior de las pistas de natación (a veces en geles concentrados) o como precipitados en el fondo de la muestra. La razón principal es que el agente reductor se oxida durante el proceso de inactivación por calentamiento, lo que hace que las moléculas de proteína originales se disocian, se repliegan y se combinan, y las subunidades se vuelven a conectar. La razón principal es que el agente reductor se oxida durante el proceso de calentamiento y pierde su actividad, lo que hace que las moléculas de proteína disociadas se repliquen, se recombinen con sustituyentes y se polimericen en macromoléculas con un peso molecular mayor que la tira objetivo y, a veces, no pueden ingresar a la gel de separación. Pero tiene la misma actividad inmunológica que la banda diana, como puede verse en la reacción WB del anticuerpo correspondiente a la banda diana.

Procesamiento: Después de calentar y hervir, agregue una cantidad adecuada de DTT o β-mercaptoetanol para complementar el agente reductor insuficiente o agregue una cantidad adecuada de EDTA para evitar que el agente reductor se oxide.

Zapatillas ¿Por qué el azul de bromofenol no se puede utilizar como indicador?

A menudo nos encontramos con este fenómeno: el azul de bromofenol sale del fondo del plato, pero la proteína no baja. Esto está relacionado principalmente con la concentración de tampón y gel de separación.

Método de tratamiento: Reemplazar el tampón con el valor de pH correcto; reducir la concentración del gel de separación.

¿Por qué las bandas de electroforesis son tan gruesas?

Es un fenómeno común que la banda de electroforesis sea muy gruesa, causado principalmente por una concentración insuficiente.

Método de procesamiento: aumente adecuadamente la longitud del gel de apilamiento; asegúrese de que el valor de pH de la solución de almacenamiento del gel de apilamiento sea correcto (6,7);

Formulario de solicitud; : ¿Por qué el voltaje de electroforesis es tan alto y la corriente tan baja?

Los principiantes son propensos a este fenómeno. Por ejemplo, el voltaje está por encima de 50 V, pero la corriente está por debajo de 5 mA. La razón principal es que el tanque de electroforesis no está ensamblado correctamente y la corriente no forma un camino. Incluyendo: a. Los tanques interior y exterior están instalados al revés; b. Hay muy poco líquido fuera del tanque. c. No se ha quitado el aislante en el fondo del tanque de electroforesis (como usar goma para verter pegamento).

Método de tratamiento: Basta con montar correctamente el tanque de electroforesis.

El gel de apilamiento y el gel de separación están rotos y hay burbujas entre las placas. ¿Afectará esto a la electroforesis?

Esta situación se da principalmente entre principiantes y generalmente tiene poco impacto en la electroforesis. El primero se debe principalmente a un tirón desigual del peine o una fuerza excesiva; el segundo se debe al hecho de que la tabla no se presiona firmemente después de levantar la abrazadera de fabricación de pegamento y entra aire en la tabla.

El tiempo de pegado es incorrecto, demasiado lento o demasiado rápido ¿Qué debo hacer?

Generalmente, el tiempo de gel del pegamento es de 30 minutos a 1 hora. Si es demasiado lento, puede ser porque el pegamento se ha despegado del tablero. Si la gelificación es demasiado lenta, TEMED o APS pueden tener una dosis insuficiente o ser ineficaces. El APS debe disolverse inmediatamente después de su uso, mientras que el TEMED es inestable y se oxida fácilmente hasta volverse amarillo. Si la velocidad del gel es demasiado rápida, es posible que se utilice demasiado APS y TEMED. El gel es demasiado duro y fácil de romper, y el gel es fácil de quemar durante la electroforesis.