¿Cuáles son los principios y métodos de preparación de medios de cultivo?
Tienes que determinar los ingredientes del medio de cultivo que vas a mezclar y luego decidir qué vas a utilizar. Antes de prepararlo, es necesario preparar el recipiente del medio de cultivo, ya sea un tubo de ensayo, una placa de Petri o un matraz Erlenmeyer. Después depende de si preparar medio de cultivo sólido o medio de cultivo líquido, y si poner agar o gelatina. Luego busca un vaso de precipitados grande y pon en él una a una las sustancias que quieras poner. Si es un medio sólido, calienta el medio con agar o gelatina en una estufa eléctrica. Una vez que el agar o la gelatina se hayan disuelto por completo, envasa rápidamente mientras esté caliente. Posteriormente, se sella el medio de cultivo en alícuotas y luego se selecciona la esterilización en seco o la esterilización en húmedo. Después de la esterilización, se completa la preparación del medio de cultivo.
Preparación y esterilización de medios de cultivo
1 Objetivo
1.1 Conocer y dominar los métodos de preparación y envasado de medios de cultivo.
1.2 Dominar diversos métodos y tecnologías de esterilización en laboratorio.
Principio 2
El medio es una mezcla de nutrientes para el crecimiento, la reproducción y el metabolismo microbiano. Dado que los microorganismos tienen diferentes tipos nutricionales, diferentes requisitos de nutrientes y diferentes propósitos para experimentos e investigaciones, se utilizan muchos tipos de medios de cultivo y diferentes materias primas. Pero desde el punto de vista nutricional, el medio de cultivo generalmente contiene fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, auxinas y agua necesarias para los microorganismos. Además, el medio de cultivo también debe tener un valor de pH adecuado, una determinada capacidad tampón, un determinado potencial redox y una presión osmótica adecuada.
El agar es una sustancia coloidal extraída del agar y otras algas, y es el coagulante más utilizado. El medio de cultivo hecho de agar se funde a 98~100 ℃ y se solidifica por debajo de 45 ℃. Sin embargo, después de repetidas fusiones, su coagulabilidad disminuye.
Una vez elaborado cualquier medio de cultivo, se debe esterilizar minuciosamente a tiempo para realizar un cultivo puro. Generalmente, los medios de cultivo se esterilizan mediante vapor a alta presión.
3 Materiales
3.1 Utensilios y materiales
Balanza, papel para pesar, cuchara de cuerno, papel para prueba de pH de precisión, probeta medidora, vaso esmaltado graduado, tubo de ensayo, Botellas triangulares, embudos, gradillas dispensadoras, pipetas y barriles de pipetas, placas de Petri y cajas de placas de Petri, varillas de vidrio, vasos de precipitados, gradillas para tubos de ensayo, cestas de alambre, tijeras, lámparas de alcohol, algodón, hilo, papel kraft o periódico, gasa, tubos de látex. , estufas eléctricas, esterilizadores, cajas de secado.
3.2 Reactivos farmacéuticos
Peptona, extracto de ternera, NaCl, K2HPO4, agar, NaNO3, KCl, MgSO4, FeSO4, sacarosa, maltosa, xilosa, glucosa, galactosa, lactosa, Zumo de patata , medidor de brotes de soja, fosfato amónico, solución de 5NaOH y solución de 5HCl.
4 Procesar
Pesar el fármaco → disolver → ajustar el pH → fundir el agar → filtrar y envasar → envolver y etiquetar → esterilizar → inclinar o inclinar la placa.
5 pasos
5.1 Preparación del medio de cultivo
5.1.1 Pesaje de medicamentos
Según la fórmula del medio de cultivo, pesarlos con precisión en secuencia Tome varios medicamentos y colóquelos en un vaso de precipitados del tamaño adecuado sin agregar agar. La peptona absorbe fácilmente la humedad y debe pesarse rápidamente.
5.1.2 Disolución
Utiliza una probeta graduada para tomar una determinada cantidad de agua destilada (aproximadamente 0/2 de la cantidad total de 65438) y verterla en el vaso de precipitados. Calentar en una estufa eléctrica con malla de amianto y remover con una varilla de vidrio para evitar que el líquido se desborde. Una vez que los distintos medicamentos se hayan disuelto por completo, deje de calentar y reponga agua. Si hay almidón en la fórmula, primero use una pequeña cantidad de agua fría para convertir el almidón en una pasta, caliente y revuelva al fuego, luego agregue suficiente agua y otras materias primas, y luego reponga el agua después de que se haya disuelto por completo. .
5.1.3 para ajustar el valor del pH.
Según los requerimientos de pH del medio de cultivo, utilizar solución 5NaOH o 5HC1 para ajustar al pH requerido. El valor del pH se puede medir con un papel de prueba de pH o un medidor de acidez.
5.1.4 Agar disuelto
Al medio sólido o semisólido se debe añadir una determinada cantidad de agar. Después de agregar el agar, colóquelo en la estufa eléctrica mientras revuelve y calienta. Deje de revolver cuando el agar esté completamente derretido y agregue agua (es necesario precalentar el agua). Preste atención a controlar el fuego para evitar que el medio se desborde o se queme.
5.1.5 Filtración y embalaje
Primero instale el dispositivo de filtración (Figura 3-1). Si es un medio de cultivo líquido, coloque una capa de papel de filtro en el embudo de vidrio, si es un medio de cultivo sólido o semisólido, coloque varias capas de gasa en el embudo o coloque un algodón fino y absorbente entre dos capas de gasa; y filtrar mientras esté caliente. Inmediatamente después de filtrar, tomar alícuotas. Al empaquetar, tenga cuidado de no contaminar el medio de cultivo en la boca del tubo o botella para evitar que el tapón de algodón se moje y cause contaminación. La altura del envase del líquido debe ser aproximadamente 1/4 de la altura del tubo de ensayo. La capacidad de envasado de sólidos es 1/5 de la altura del tubo y la capacidad de envasado de tubos de ensayo semisólidos es generalmente 1/3 de la altura del tubo. La cantidad de envasado de matraces Erlenmeyer no debe exceder la mitad del volumen del Erlenmeyer; matraces.
5.1.6 Marca de vendaje
Después de empaquetar el medio de cultivo, agregue un tapón de algodón o una tapa del tubo de ensayo, envuélvalo con una capa de papel resistente a la humedad y átelo con una cuerda de algodón. Marque el nombre del medio, el grupo de preparación, el nombre y la fecha en el papel de embalaje.
5.1.7 Esterilización
El medio de cultivo anterior debe esterilizarse a tiempo de acuerdo con las condiciones especificadas en la fórmula del medio de cultivo. El medio de cultivo ordinario se mantiene a 121°C durante 20 minutos para asegurar el efecto de esterilización sin destruir los ingredientes activos del medio de cultivo. Si el medio de cultivo esterilizado necesita usarse como medio de cultivo sólido en pendiente, debe colocarse como pendiente inmediatamente después de la esterilización (Figura 3-2). La longitud de la pendiente generalmente no excede la mitad de la longitud de la pendiente. tubo de ensayo después de la esterilización del medio de cultivo semisólido, concentrar verticalmente en agar profundo semisólido.
5.1.8 Invertir la placa
Enfriar el medio de cultivo a 45 ~ 50 ℃ en un baño de agua e invertir la placa inmediatamente.
5.2 Método de esterilización
La esterilización se refiere a matar o destruir todos los microorganismos en un ambiente determinado. Los métodos de esterilización se pueden dividir en dos categorías: esterilización física y esterilización química. Este experimento introduce principalmente uno de los métodos físicos, a saber, la esterilización por calor.
La esterilización térmica incluye la esterilización por calor húmedo y la esterilización por calor seco. Al calentar, las proteínas de las bacterias se coagulan y desnaturalizan, logrando así el propósito de la esterilización. La desnaturalización por coagulación de las proteínas está relacionada con su propio contenido de agua. Cuanto mayor sea el contenido de humedad, menor será la temperatura requerida para la condensación. A la misma temperatura, el efecto de esterilización del calor húmedo es mayor que el del calor seco, porque en el caso del calor húmedo, las bacterias absorben agua, lo que hace que las proteínas sean fáciles de coagular, al mismo tiempo, el calor húmedo tiene una fuerte penetración, lo que puede; aumentar el efecto de esterilización.
5.2.1. Método de esterilización con vapor a alta presión
La esterilización con vapor a alta presión es ampliamente utilizada y altamente eficiente. Es el método de esterilización más utilizado en experimentos de microbiología. Este método de esterilización está diseñado basándose en el principio de que el punto de ebullición del agua aumenta con el aumento de la presión del vapor. Cuando la presión del vapor alcanza 65438±0,05 kg/cm2, la temperatura del vapor aumenta a 65438±0,265438±0 ℃. Después de 65438±0,5 ~ 30 minutos, se pueden matar varios microorganismos y sus esporas en los elementos de la olla. Con este método se pueden esterilizar medios de cultivo generales, cristalería, muestras infecciosas y ropa de trabajo (Figura 3-4).
5.2.1.1 Los métodos de operación y las precauciones son los siguientes.
Agua
Abre la tapa del recipiente de esterilización y añade agua al recipiente hasta el nivel del agua. Lo mejor es utilizar agua hirviendo de un esterilizador vertical para reducir la acumulación de sarro en la olla. Al esterilizar, asegúrese de agregar suficiente agua para evitar que la olla se seque.
Carga y tapado
Después de colocar los materiales de esterilización, cierre la tapa del esterilizador y apriete los tornillos de la tapa en diagonal para que la vaporera sea hermética y evitar fugas de aire.
Ventilación
Abra el puerto de escape (también llamado válvula de purga). Calentar con estufa eléctrica. Cuando el agua hierve, el vapor y el aire se expulsan juntos por el respiradero. Cuando se descargue una gran cantidad de vapor, se mantendrá durante 5 minutos para permitir que se descargue por completo el aire frío de la olla.
Aumentar, mantener y reducir la presión
Cuando se agota el aire frío de la olla, se puede cerrar la válvula de escape y la presión comienza a subir. Cuando la presión aumenta a la presión requerida, se controla el voltaje para mantener la temperatura constante y se comienza a calcular el tiempo de esterilización. Después de que el tiempo alcance el tiempo requerido (generalmente, la esterilización de los medios de cultivo y los utensilios se controla a 121 ° C durante 20 minutos), deje de calentar. Cuando la presión caiga cerca de "0", abra la válvula de aire. Tenga cuidado de no expulsar el aire demasiado pronto o demasiado rápido, de lo contrario el líquido de la botella saldrá corriendo del recipiente porque la presión en la botella cae más lentamente que en la olla.
Cultivo en blanco de medio estéril
El medio esterilizado se cultiva en una incubadora a 37°C y se puede almacenar para su uso posterior después de 24 horas de crecimiento estéril. Después de sacar el medio de cultivo inclinado, colóquelo inmediatamente en el medio inclinado y luego cultívelo en el blanco; el medio de cultivo semisólido se coloca verticalmente, se concentra en agar profundo semisólido y luego se cultiva en el blanco.
Método de esterilización por calor seco
El método de utilizar aire caliente seco para matar microorganismos se llama esterilización por calor seco. Generalmente, los artículos que se van a esterilizar se envasan y se hornean en un horno eléctrico, es decir, se calientan a 160 ~ 170 °C durante 1 ~ 2 horas.
La esterilización por calor seco se utiliza habitualmente para esterilizar cristalería y artículos metálicos vacíos. Cualquier cosa que contenga caucho, medios líquidos y sólidos no se puede esterilizar de esta manera.
Preparación antes de la esterilización
La cristalería debe envolverse y taparse antes de la esterilización para garantizar que no se contamine con bacterias externas después de la esterilización. Los métodos comúnmente utilizados para envolver cristalería incluyen: envolver el plato con papel o colocarlo en un tubo de placa de metal con papel grueso fuera del tapón de algodón y la boca de la botella, y apretarlo con una cuerda de algodón con un nudo corredizo para evitarlo. la boca del biberón sea esterilizada y contaminada por bacterias externas; coloque un extremo de la pajita en el centro del algodón con un clip enderezado e introdúzcalo suavemente en la boquilla. La estanqueidad debe ser moderada y la llama debe quemar uniformemente las fibras de algodón expuestas por la boquilla. Al desinfectar, coloque la pajita en un tubo de metal para desinfectar. También puede envolver un trozo de papel en diagonal desde la punta de la pajita y enrollarlo gradualmente. Aplana el rollo de papel en el extremo de la cabeza, gíralo unas cuantas veces y luego esteriliza las pajitas envueltas juntas.
5.2.2.2 Esterilización en horno de secado
Coloque los artículos envueltos en el horno. Tenga cuidado de no colocarlos demasiado cerca para evitar bloquear la circulación del aire y no permita que los aparatos entren en contacto directo. la capa interior del horno. Aumente la temperatura del horno a 160 ~ 170 ℃ y manténgala constante durante 1 ~ 2 h. Tenga cuidado de no dejar que la temperatura suba demasiado. Si la temperatura supera los 170°C, el papel y el algodón envueltos fuera del recipiente se chamuscarán y quemarán. Si se seca cristalería, la temperatura es de 120°C y el tiempo es de 30 minutos. Cuando la temperatura desciende a 60~70 ℃, la puerta se puede abrir para sacar los artículos; de lo contrario, la cristalería explotará debido al enfriamiento repentino.
Nunca envuelvas cosas en aceite o papel encerado al desinfectar de esta manera.
5.2.2.3 Esterilización por llama
Esterilización por combustión directa de llama, rápida y completa. Las asas de inoculación, las agujas de inoculación u otros utensilios metálicos se pueden esterilizar directamente quemándolos sobre la llama de una lámpara de alcohol hasta que estén al rojo vivo. Además, durante el proceso de inoculación, también se esteriliza a la llama la boca del tubo de ensayo o matraz.
6 resultados
6.1 Registre el método de esterilización y las condiciones de esterilización (temperatura, presión, etc.) utilizadas para varios artículos.
6.2 Describa el proceso y las precauciones de la esterilización con vapor a alta presión.
7 Reflexiones
7.1 ¿Cuál es el procedimiento general para preparar medios de cultivo?
7.2 Después de realizar este experimento, ¿a qué crees que se debe prestar atención a la hora de preparar el medio de cultivo?
7.3 ¿Cuál es la importancia de la esterilización en experimentos de microbiología?
Describir los métodos y principios operativos de la esterilización por vapor a alta presión.
5 ¿A qué debemos prestar atención cuando utilizamos la esterilización por alta presión?