Cómo utilizar el antibiótico G418 para detectar clones positivos después de transferir el plásmido a las células

G418 bloquea la síntesis de proteínas en las células interfiriendo con la función de los ribosomas. Los clones positivos pueden sobrevivir porque contienen genes de resistencia.

Dado que la proteína tarda un tiempo en expresarse después de que el gen se transfecta en las células, el cribado no debe realizarse demasiado pronto.

Generalmente, el cribado de G418 debe iniciarse a las 24 horas. después de la transfección. A medida que las células se metabolizan, la concentración y la actividad de G418 disminuirán, por lo que la solución de detección que contiene G418 debe reemplazarse cada 3 a 5 días. En este momento, la concentración del fármaco se puede reducir a 200 ug/ml.

Después. Al agregar el medicamento, bajo gran aumento, los clones positivos y los clones negativos son fáciles de identificar. Marque el clon positivo con un marcador. Luego, raspe los clones negativos, digiera los clones positivos y continúe con el cribado y el cultivo. Finalmente, utilice el método de dilución limitante para cribar los clones positivos en una placa de 96 pocillos.

Generalmente, después de aproximadamente 4 semanas de cribado. , los clones positivos obtenidos son todos relativamente estables