Principios y aplicaciones de la expresión genética ATAC de multiómica unicelular de genómica 10x
1.10x Genomics Principio Unicelular Multi-omics Tecnología de expresión genética ATAC
Para obtener el transcriptoma y el epigenoma de la misma célula al mismo tiempo, 10x Genomics Single Cell ATAC Gene La tecnología de expresión utiliza primero la transposasa Tn5 para transponer el ADN nuclear en la suspensión nuclear. La transposasa Tn5 corta preferentemente el ADN nuclear en regiones abiertas de cromatina. Luego, se utilizó la plataforma Chromium para preparar bibliotecas ATAC y de expresión génica unicelular (GEX). En este proceso, los núcleos de células individuales, los reactivos de reacción y las perlas de gel individuales se encapsulan en gotitas (GEM). Las perlas de gel incluyen una secuencia poli(dT) con un código de barras específico (código de barras 10x), un identificador molecular único (UMI) y una secuencia espaciadora con un código de barras 10x. La secuencia poli(dT) puede capturar ARNm de cola poli(dA) para generar una biblioteca de expresión génica (GEX), y la secuencia espaciadora puede agregar un código de barras al fragmento de ADN transpuesto para generar una biblioteca ATAC. Secuenciar las dos bibliotecas obtenidas y utilizar códigos de barras 10x para hacer coincidir los datos de secuenciación de las dos bibliotecas de la misma célula, logrando así la asociación simultánea del transcriptoma y el epigenoma de la misma célula.
2. Ventajas técnicas de la expresión del gen ATAC unicelular de 10x Genomics
1. Una célula, dos interpretaciones
Aprendizaje del gen ATAC unicelular multigrupo de 10x Genomics La tecnología de expresión puede aprovechar al máximo las muestras y obtener información tanto del transcriptoma como del epigenoma de una célula, maximizando la información multinivel a partir de muestras limitadas.
Utilizando la tecnología de expresión génica ATAC de genómica unicelular 10x, la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford en Estados Unidos obtuvo las líneas celulares de cáncer colorrectal COLO320-DM (oncogén MYC amplificado en ecDNA) y COLO320 del mismo paciente. Se obtuvieron transcriptomas emparejados y accesibilidad a la cromatina en 72.049 células de -HSR (oncogén MYC amplificado en amplicones cromosómicos en tándem (HSR)). La agrupación celular de datos de ATAC-seq unicelular y RNA-seq unicelular muestra una agrupación independiente de líneas celulares COLO320-DM y COLO320-HSR. ¿En relación con la HSR cromosómica? ¿COLO320-HSR amplificado con MYC en ecDNA? Las puntuaciones de expresión de ARN y accesibilidad de MYC en COLO320-DM amplificado con MYC son muy heterogéneas, lo que sugiere que la actividad variable de los elementos reguladores puede explicar las diferencias en la expresión de oncogenes entre células.
2. La combinación de los dos resultados de agrupación puede identificar tipos de células con mayor precisión.
La tecnología de expresión génica ATAC multiómica unicelular de 10x Genomics puede utilizar datos de transcriptoma y epigenoma para agrupar células, caracterizar mejor la heterogeneidad celular de poblaciones celulares complejas y encontrar opiniones ocultas. Además, las firmas epigenéticas se pueden interpretar más fácilmente mediante el uso de marcadores de expresión genética.
Investigadores del Broad Institute del MIT y de la Universidad de Harvard utilizaron la tecnología de expresión génica ATAC ómica unicelular para obtener epigenomas y genomas de alta calidad de 34.774 células de piel de ratón adulto. Al analizar estos dos datos, se descubrió que no solo se pueden distinguir tipos de células de diferentes linajes, sino también tipos de células estrechamente relacionados, como CD 34 α-alto y CD 34 α-bajo. Los grupos de células basadas en ARN también se pueden distinguir por las características de accesibilidad a la cromatina, y su identidad puede confirmarse aún más. Por ejemplo, la anotación de grupos basada en la actividad de los determinantes del linaje reveló activadores transcripcionales completos Dlx3 y Sox9 y represores Zeb1 y Sox5.
Algunos estados celulares se pueden identificar con mayor resolución mediante cromatina o firmas de expresión genética. Por ejemplo, la agrupación de grupos de células según sus características de agrupamiento reveló diferencias más pronunciadas en la accesibilidad a la cromatina entre las partes permanentes y regenerativas de los folículos pilosos. Por el contrario, las células correspondientes a la capa granular se distinguieron más fácilmente en grupos únicos en el nivel de expresión genética.
3. La correlación entre transcriptoma y epigenoma descubre nueva regulación genética.
La tecnología de expresión génica ATAC de 10x Genomics Single Cell Multi-omics puede combinar elementos reguladores con la expresión génica para explorar las interacciones reguladoras de genes que impulsan la diferenciación celular, el desarrollo y la enfermedad.
Investigadores de la Universidad de Washington aplicaron la tecnología de expresión génica ATAC multiómica unicelular al tejido renal de ratones macho de 8 semanas de edad y obtuvieron mapas de accesibilidad de la cromatina y el transcriptoma de 11.296 células, y encontraron asociaciones. entre 1.260 sitios distales y 321 genes. Los sitios 44 estaban asociados con el TSS más cercano y 21 estaban asociados con el segundo TSS más cercano. El gen marcador Slc12a3 de las células del túbulo distal tiene la mayor correlación con su sitio de 36 kb ubicado aguas abajo del TSS y se superpone con su último exón. Para las células del túbulo distal, este sitio es ligeramente más accesible. La relación entre los elementos reguladores cis distales y sus genes diana ayuda a explicar la expresión diferencial en diferentes tipos de células. Por ejemplo, la expresión específica del tipo de célula de Slc6a18 (un gen marcador para las células S3 del tipo 2 del túbulo proximal) no se refleja en la accesibilidad de un promotor específico del tipo de célula. Su TSS está relacionado con un sitio a 16 kb de distancia. , la accesibilidad de este sitio está relacionada con la expresión de SLC6a18.
Tres. Campos de aplicación de la expresión del gen ATAC unicelular de la genómica 10x
Debido a las limitaciones de la genómica unicelular, poco después de la aparición de la tecnología de secuenciación ATAC unicelular, la aplicación simultánea de la secuenciación ATAC unicelular y Se adoptó la secuenciación ATAC celular. Estrategias para secuenciación de ARN celular. En la actualidad, esta estrategia se ha utilizado ampliamente en diferentes campos, como el desarrollo de órganos, la investigación de la patogénesis de enfermedades y el cáncer, y se han publicado casi 50 artículos. El método de utilizar directamente la tecnología de expresión génica ATAC ómica unicelular para analizar el transcriptoma y el epigenoma de la misma célula también se ha aplicado a la corteza cerebral de ratones neonatales y adultos, a células de cáncer de pulmón tratadas con dexametasona, a riñón de ratón y a embriones de ratón. y piel de ratón. Junio de 5438 En febrero de 2020, utilizando la tecnología de expresión génica ATAC unicelular del genoma 10x, se informó por primera vez sobre el estudio de la expresión de oncogén cooperativo intermolecular impulsado por el centro de ecDNA.
1. Caso: El análisis de la expresión del gen ATAC multiómico unicelular revela el mecanismo de determinación del linaje en la piel de ratón.
Fecha de publicación: 165438 Octubre 2020
Publicado por el Broad Institute del MIT y la Universidad de Harvard, entre otros.
Revista editorial: Cell
Factor de impacto: 38,637
1) Antecedentes de la investigación
Diferenciación celular y función en muchos niveles de regulación genética están regulados, incluida la regulación de la expresión genética a través de cambios en la accesibilidad a la cromatina. Sin embargo, la diferenciación es un proceso asincrónico, lo que dificulta la comprensión de los eventos reguladores que conducen al destino celular.
2) Materiales y métodos
Tecnología de expresión génica ATAC multiómica unicelular (SHARE-seq), piel, pulmón y tejido cerebral de ratón.
3) Resultados de la investigación
A. El análisis multiómico no solo puede distinguir tipos de células de diferentes linajes, sino que también se pueden distinguir tipos de células estrechamente relacionadas basadas en ARN; mediante características de accesibilidad de la cromatina se caracterizan aún más; algunos estados celulares se pueden identificar con mayor resolución a través de cromatina o firmas de expresión genética.
B. Se identificaron 63.110 asociaciones de genes pico en piel de ratón adulto, con algunos picos individuales asociados con cuatro o más genes. Las regiones de cromatina reguladora (DORC) asociadas con genes máximos se superponen con superpotenciadores.
C.DORC es rico en genes reguladores clave conocidos en todos los linajes.
Existen diferencias significativas en DORC incluso entre poblaciones de células estrechamente relacionadas, lo que indica que DORC es altamente específico del tipo de célula.
D. Los DORC generalmente se vuelven accesibles antes de que comience la expresión de sus genes asociados, lo que coincide con el inicio del linaje. Es una hipótesis de larga data que la activación del potenciador predice la expresión del gen objetivo e implica la accesibilidad a la cromatina como un marcador de iniciación del linaje.
E. Los cambios en todo el genoma en la accesibilidad de la cromatina reflejan estados celulares iniciados por el linaje, y el potencial de la cromatina puede predecir estados celulares futuros en escalas de tiempo más grandes que la velocidad del ARN, especialmente durante el proceso de diferenciación.
Referencias:
1.King L. Hung, Kathryn E, Xie, et al. El centro de ADNc impulsa la expresión coordinada de oncogenes intermoleculares. [J]. bioRxiv, 2020.11.19.390278.
2. Marsella, Zhang Bing, LaFaveLindsay M, etc. Identificación del potencial de la cromatina a través de perfiles unicelulares compartidos de ARN y cromatina. [J]. Celda, 2020, 183:1103-1116.
3. Cao Junyue, Cusanovich DarrenA, Ramani Vijay, etc. Análisis conjunto de la accesibilidad a la cromatina y la expresión genética en miles de células individuales. [J]. Ciencia, 2018, 361: 1380-1385.