¿Adquisición de semillas de maíz transgénicas mediada por Agrobacterium?
1.2 Obtención de trigo transgénico mediante el método de paso del tubo polínico El trabajo de trigo transgénico utilizando el método de paso del tubo polínico se concentró principalmente en los primeros cinco años (1990-1995) y se concentró principalmente en China. Zhou Wenlin et al. informaron que el ADN de cultivos C4 se introdujo en el trigo de primavera a través de tubos polínicos, y se obtuvo trigo transgénico y su descendencia con algunos rasgos C4. Cheng Zhuomin y otros afirmaron haber obtenido trigo transgénico transformado con el gen CP del virus del enanismo amarillo del trigo y Liu Genqi también informaron haber obtenido trigo transgénico utilizando el método de paso del tubo polínico. Desafortunadamente, estos informes en ese momento carecían de evidencia biológica molecular de la integración y expresión de genes extraños (o ADN) en plantas de trigo transgénicas y su progenie. Recientemente, Zeng Junzhi y Wu et al. analizaron la expresión de "genes" exógenos en la progenie de trigo transgénico obtenida por el método del canal polínico durante el período 1990-1994, incluyendo análisis por métodos de biología molecular, comprobando la integración y expresión de genes exógenos, lo que demuestra que se puede obtener trigo transgénico mediante el método de paso del tubo polínico. Zhou Wenlin, Ni et al. (comunicación personal) utilizaron el gen quimérico eMS/Bar que construimos para transducir trigo y obtuvieron plantas masculinas y resistentes a los herbicidas, y su descendencia aún mostró resistencia a los herbicidas. El método de paso del tubo polínico evita el complicado proceso de cultivo de tejidos y regeneración de plantas, y es un método prometedor para la transducción de genes del trigo.
1.3 El trigo transgénico obtenido por otros métodos directos, como la microinyección, la punción con microhaz láser, la estimulación eléctrica mediada por PEG, etc., son casi ineficaces en la transformación del trigo. Aunque muchos estudios han demostrado que genes exógenos pueden expresarse transitoriamente en protoplastos y células tratadas con estos métodos directos e incluso expresarse de manera estable en el callo producido, sólo existe un informe sobre la adquisición de plantas de trigo transgénicas. Cómo utilizó los protoplastos de la variedad "Hartog" como receptores y obtuvo plantas transgénicas verdes resistentes a herbicidas (PPT) mediante estimulación eléctrica, pero estas plantas no lograron dar frutos. La dificultad en la regeneración de los protoplastos del trigo o de las plantas unicelulares puede ser la principal razón del fracaso de métodos directos como la estimulación eléctrica, el PEG y la microinyección en los transgénicos del trigo. Precisamente debido a estas dificultades, las perspectivas de métodos directos que utilicen protoplastos o células individuales como receptores en la transducción de genes del trigo se han vuelto muy sombrías.
1.4 Método mediado por Agrobacterium para obtener trigo transgénico Desde la aparición de la primera planta transgénica mediada por Agrobacterium en 1983, el método mediado por Agrobacterium se ha convertido rápidamente en el método dominante para la transducción de genes de plantas dicotiledóneas. Este método es simple de operar, de bajo costo, alta eficiencia de transformación, alta tasa de integración de genes de copia única y el gen exógeno es estable en la progenie de plantas transgénicas. La posibilidad de introducir este método en la transducción de genes de monocotiledóneas, incluido el trigo, se convirtió en un tema candente de discusión e investigación en la década de 1990. En ese momento, existía una tendencia a creer que las monocotiledóneas no eran huéspedes naturales de Agrobacterium, sino una transformación mediada por Agrobacterium. monocotiledóneas es casi imposible o imposible.
El representante de este punto de vista es el científico suizo Potricus, que ha logrado grandes logros en el cultivo de tejidos y la transducción de armas genéticas en cultivos de cereales como el trigo. Sus opiniones pesimistas las ha publicado en prestigiosas revistas internacionales "Biology/Technology" y "Nature". El método mediado por Agrobacterium para obtener plantas de espárragos transgénicos, especialmente arroz y maíz transgénicos, no sólo cambia la opinión de que las monocotiledóneas no son los huéspedes naturales de Agrobacterium, sino que también demuestra que el método mediado por Agrobacterium se puede utilizar para la transformación genética de cultivos de cereales. .
En términos de trigo, aunque ya en 1988 se demostró que Agrobacterium puede infectar y transformar genéticamente, más tarde se demostró que Agrobacterium puede adherirse a células embrionarias de trigo parcialmente digeridas enzimáticamente y no enzimáticamente digeridas. Hace muchos años que no se obtienen plantas. Hess et al. informaron que se obtuvieron plantas transgénicas con resistencia a antibióticos e hibridación por transferencia Southern inoculando directamente Agrobacterium en espiguillas, pero no se detectaron genes extraños en F1 y F2. Después de la polinización artificial, los pistilos se trataron con Agrobacterium (cepa C158) que porta el vector de fusión * * * (pCV2260 y pSIR42). Se confirmó mediante PCR e hibridación Southern que pukhal'skii obtuvo plantas F1, obteniendo así plantas F2 que contienen genes extraños. Este sencillo método de transformación genética combina las ventajas de la administración de polen y la infección por Agrobacterium y, si lo confirman otros laboratorios, desempeñará un papel destacado en la transformación genética del trigo.
En términos de transducción de genes de trigo mediada por Agrobacterium, Cheng et al. rompieron más de diez años de silencio y obtuvieron plantas de trigo transgénicas normales por primera vez en 1997. Dos años más tarde, el científico chino Xia Guangmin y otros informaron sobre la adquisición de plantas de trigo transgénicas mediadas por Agrobacterium, y el equipo de investigación del autor también obtuvo con éxito plantas de trigo transgénicas mediadas por Agrobacterium (por publicar). Este éxito significa que el trigo puede disfrutar de todas las ventajas de la transformación genética mediada por Agrobacterium, como las dicotiledóneas.
El "método mediado por Agrobacterium" combina el método mediado por Agrobacterium y el método de disparo con pistola genética, o ayuda a Agrobacterium a unir y transferir el plásmido contenido en él a las células receptoras a través de los microporos causados por los microproyectiles. , o introducir tres plásmidos y fragmentos exógenos que llevan secuencias fronterizas de vir D1, VirD2 y ADN-T en el receptor, y promover el fragmento diana exógeno a través de la expresión normal de vir D1 y VirD2 que ya tienen genes de trigo en el receptor. el genoma receptor en un número de copias más bajo. La transformación mediada por Agrobacterium asistida por ultrasonido (SAAT) utiliza microporos generados por ultrasonido para ayudar a Agrobacterium a fijar y transferir su plásmido a las células receptoras. En comparación con el método puro de Agrobacterium, el gen extraño se transfiere de forma transitoria a las células receptoras del trigo. aumentado al menos 100 veces. Singh, Chawla y Serik también utilizaron fibras de carburo de silicio para ayudar a los transgenes de Agrobacterium. Además, existen métodos de “infección por Agrobacterium” que combinan Agrobacterium con virus. Aunque estos métodos aún están inmaduros, tienen un gran potencial para la transducción de genes en el trigo.
2. Receptor de transformación genética del trigo
El receptor para la transformación genética depende del método transgénico utilizado, y la dificultad de funcionamiento del receptor determina el éxito o el fracaso del método transgénico.
Las células embriogénicas de trigo en suspensión y sus protoplastos aislados se utilizan a menudo como receptores de métodos transgénicos directos, como la estimulación eléctrica, el PEG y la microinyección. Precisamente por la dificultad de regenerar plantas a partir de protoplastos y células en suspensión, los métodos directos como la estimulación eléctrica no son muy útiles en la transformación genética del trigo. El callo embriogénico del trigo, especialmente el embrión inmaduro y su callo, el escudo embrionario inmaduro y su callo, tiene una fuerte capacidad de regeneración de plantas (algunas personas piensan que tiene una gran proporción de células totipotentes) y puede usarse como gen de Bombardeo o Agrobacterium- La regeneración mediada por plantas transgénicas se ha convertido hasta ahora en el principal receptor para la transformación genética del trigo. Al mismo tiempo, el método biolístico se ha convertido en el principal método para la transformación genética del trigo en la actualidad, y el método mediado por Agrobacterium también puede convertirse en el principal método para la transformación genética del trigo en el futuro. Los resultados experimentales del grupo de investigación del autor en los últimos años (que se publicarán) muestran que el callo de las anteras del trigo tiene una gran capacidad de regeneración y es más fácil obtener plantas transgénicas después del bombardeo con armas genéticas, por lo que también es un buen receptor de transgenes de trigo. . Los meristemas de trigo tienen un gran potencial para su uso como receptores de armas genéticas "portátiles", pero es necesario mejorar el desarrollo de este potencial para que sea económicamente viable. Como único receptor para el método de canalización del tubo polínico y el método de canalización del polen de Agrobacterium, el pistilo desempeñará un papel cada vez más importante en los transgénicos de trigo con la mejora de estos métodos transgénicos, y puede desempeñar un papel de liderazgo.
Las microsporas, el polen, las megasporas y las bases de las hojas pueden desarrollarse aún más como receptores de transgenes del trigo, pero es poco probable que se conviertan en receptores importantes en un futuro próximo. Las mazorcas jóvenes pueden ser buenas receptoras de la transformación genética en el trigo. En un experimento de transformación utilizando panículas jóvenes y embriones jóvenes como receptores, Chen observó que el efecto de transformación de las panículas jóvenes era mejor que el de los embriones jóvenes.
3. Genes diana y selección de transformación genética del trigo.
Genes marcadores Hasta ahora, los genes de selección y los genes indicadores comúnmente utilizados en la transformación de genes dicotiledóneos siguen siendo los genes objetivo y los genes de selección para la transformación genética del trigo. Estos genes incluyen principalmente GUS, CAT y LUC. Resistencia a antibióticos NptII y Hpt y resistencia a herbicidas Bar, EPSPs, Bxn, CP4 y GOX. Estos genes se utilizan principalmente para establecer sistemas eficaces de transformación genética en el trigo. Con el establecimiento y mejora de los sistemas de transformación genética del trigo, está aumentando la aplicación de verdaderos genes objetivo destinados a mejorar las características del trigo. Hasta ahora, los genes diana que se han introducido en el trigo y expresado en plantas transgénicas incluyen principalmente: ① genes para mejorar la calidad del procesamiento del trigo: genes de la subunidad de glutenina de alto peso molecular lAxl, lDx5, lDxl0 y genes de la subunidad de glutenina de alto peso molecular recombinantes. ② Genes de resistencia a enfermedades: gen de la proteína de la cubierta del arroz (CP), proteínas similares a las germinales (GLP), gen similar a la proteína dulce TLP, gen de la estilbeno sintasa de la semilla de cebada, gen de la proteína inactivadora de ribosomas (RIP) y transposón ds del maíz. ③Genes quiméricos de esterilidad masculina: gen de la ribonucleasa Barnasa, gen de la proteína del citoesqueleto, etc. ④Genes de resistencia a herbicidas: Bar, EPSP, Bxn, CP4 y GOX.
Los genes de resistencia a los antibióticos, como NptII y Hpt, se utilizan ampliamente como genes de selección en dicotiledóneas, pero rara vez se utilizan en transgénicos de trigo. Hay dos razones principales: en primer lugar, el trigo tiene una alta resistencia natural al Kan y, en segundo lugar, la gente está preocupada por la seguridad de los genes antibióticos del trigo. Hasta ahora, el gen de resistencia a herbicidas Bar es el gen de selección más utilizado en el trigo modificado genéticamente.
Los genes reporteros GUS, CAT y LUC han hecho grandes contribuciones al establecimiento del sistema de transformación genética del trigo. Pero hoy en día, cuando el sistema transgénico del trigo está básicamente maduro, la gente ha comenzado a buscar otros genes para reemplazar los genes indicadores simples antes mencionados o a no utilizar ningún gen indicador. Vale la pena mencionar los marcadores visuales. McCormac et al. y Mentewab et al. utilizaron genes estimulantes de la biosíntesis de antocianinas, como Cl/Lc, como genes indicadores y seleccionaron transformantes transformando el color de los receptores y sus células. Este es un gen informador con un amplio valor de aplicación. Además, también se ha informado de la transformación genética del gen sintético de la proteína verde fluorescente (SGFP-S65T) en el trigo.
4. Expresión y análisis de genes extraños en trigo transgénico.
CaMV 35s, un promotor ampliamente utilizado para la expresión constitutiva de genes extraños en plantas transgénicas, tiene un efecto débil en cereales. Para mejorar la expresión de genes extraños en el trigo transgénico, las personas usan secuencias dobles de CaMV35s, agregan inserciones de genes monocotiledóneos (como el inserto del gen Adhl del maíz) o cambian a promotores de genes monocotiledóneos, como el promotor del gen Actl del arroz. y el promotor del gen Ubil del maíz. Los promotores Actl y Ubil son los promotores constitutivos más comúnmente utilizados en los transgénicos de trigo. Además, la intensidad de expresión de genes extraños promovidos por el promotor constitutivo recombinante artificial pEmuGN en trigo transgénico es al menos 10 veces mayor que la de CaMV35. Este promotor recombinante tiene un gran potencial en la transformación genética del trigo.
La aplicación de promotores de expresión específicos de tejidos y/u órganos es un avance importante en los transgénicos de trigo. De particular interés es la utilización de promotores específicos del polen de anteras. De Block et al. utilizaron el promotor específico ca del tapetum de las anteras del arroz para impulsar la expresión del gen de la ribonucleasa Barnse en el trigo transgénico, creando así el primer trigo masculino estéril genéticamente modificado del mundo. El grupo de investigación del autor también creó trigo masculino estéril modificado genéticamente utilizando el promotor TA29 específico del tapetum de las anteras del tabaco. La mejora y combinación del trigo masculino estéril modificado genéticamente cambiará por completo la difícil situación actual de la producción de semillas de trigo híbrido. Además, los promotores químicamente inducibles también tienen un gran potencial de aplicación en el trigo transgénico.
En los últimos años se han realizado algunos estudios sobre la integración y expresión de genes extraños en trigo transgénico, incluidos estudios moleculares.
En general, se cree que el método de integración de genes extraños en el trigo transgénico está relacionado con el método transgénico utilizado, pero ya sea un método de pistola genética o un método mediado por Agrobacterium, la copia baja y la integración simple siguen siendo los métodos de integración dominantes de los introducidos; Los genes se encuentran en líneas transgénicas. La herencia mendeliana ocurre en la mayoría de la descendencia. Los experimentos de Bieri et al. demostraron que el gen objetivo (RIP) con MAR (regiones asociadas a la matriz) todavía era muy estable en las últimas cuatro generaciones de trigo transgénico, pero Álvarez et al. en la generación T2. Según la investigación de Uze et al., los genes extraños se pueden integrar en el genoma del trigo en forma monocatenaria o bicatenaria, lineal o circular, pero la eficiencia de transformación de los genes lineales es mayor. Zupan et al. observaron que la proteína Agrobacterium VirE2 puede coordinar la captación nuclear de ADN monocatenario en células vegetales transgénicas. Srivastava et al. informaron sobre un método de "recombinación de sitio específico", mediante el cual convirtieron con éxito cuatro sitios de genes de inserción de 4 copias en genes de una sola copia.
Además, Pederson et al. también utilizaron la hibridación fluorescente in situ (FlSH) para estudiar la ubicación de genes introducidos mediante bombardeo de partículas en los cromosomas del trigo transgénico. Observaron que diferentes líneas transgénicas de la misma variedad (Florida) tienen diferentes sitios de inserción de genes extraños. Por ejemplo, el punto de inserción de una línea está en el cromosoma 6B, mientras que el punto de inserción de otra línea está en el cromosoma 2A. Una investigación en profundidad sobre este tipo ayudará a comprender el "efecto de posición" de los genes insertados y así comprender mejor la expresión y estabilidad de genes extraños en el trigo transgénico.
5. Principales problemas en la transformación genética del trigo.
Aunque la investigación sobre el trigo genéticamente modificado ha avanzado rápidamente en los últimos años, todavía existe una gran brecha en comparación con las dicotiledóneas e incluso con el arroz y el maíz, ambos cereales. La brecha más obvia es que más de 120 variedades de cultivos dicotiledóneos genéticamente modificados ya están en producción o han sido aprobadas para ensayos de campo, y varias variedades de arroz y maíz genéticamente modificados también están en práctica de producción, mientras que el trigo genéticamente modificado todavía se está estableciendo y Etapas optimizadas de sistemas transgénicos. El autor cree que la razón principal de esta diferencia son los siguientes problemas en los transgénicos de trigo:
Primero y más importante, los problemas técnicos del cultivo de tejidos de trigo. La baja tasa de regeneración de las plantas y la fuerte dependencia del genotipo en el cultivo de tejidos de trigo son obstáculos que limitan el éxito de los transgenes y aumentan significativamente la cantidad de trigo transgénico. Para las variedades de trigo con una fuerte capacidad de regeneración de plantas, como Bobwhite, las plantas transgénicas se obtuvieron mediante pistola genética o Agrobacterium tumefaciens, mientras que para aquellas con poca capacidad de regeneración de plantas, las plantas transgénicas no se pueden obtener mediante pistola genética. Precisamente debido al problema de la regeneración de variedades, el trigo transgénico en todo el mundo se concentra en un pequeño número de genotipos, que no son necesarios en la práctica de producción o tienen una aplicación limitada en la práctica de producción.
En segundo lugar, el receptor para la transformación genética es relativamente único. Los principales receptores del trigo genéticamente modificado son los embriones inmaduros y sus derivados, pero en los países en desarrollo de todo el mundo hay muy pocas personas que puedan proporcionar embriones inmaduros durante todo el año.
En tercer lugar, la excesiva dependencia de la tecnología de armas genéticas de nutria. En la actualidad, más del 90% del trigo modificado genéticamente se obtiene mediante métodos biolísticos. Las deficiencias de las plantas transgénicas biolísticas ya son evidentes en las plantas dicotiledóneas, por lo que no entraré en detalles aquí. De hecho, estas dos razones son causadas esencialmente por la primera razón. Además, el alto precio de las armas genéticas también es un factor incidental.
En cuarto lugar, falta una investigación sistemática y profunda sobre el mecanismo de transformación de Agrobacterium en plantas monocotiledóneas, especialmente el trigo. En la actualidad, la gente se ha dado cuenta de que diferentes tipos de Agrobacterium tienen diferente infectividad para la misma planta monocotiledónea, e incluso la infectividad de la misma cepa en diferentes condiciones de cultivo es obviamente diferente. Algunas monocotiledóneas, incluido el trigo, también tienen algunos factores que no favorecen la infección por Agrobacterium, como la alta esterificación de los polisacáridos de pectina en la pared celular y la falta de sitios de unión de Agrobacterium. Hay muy pocos inductores de callos secretados o faltan o son obviamente diferentes; de plantas dicotiledóneas, no favorece la transformación de Agrobacterium. Con base en estos conocimientos, la gente ha adoptado métodos como seleccionar cepas de Agrobacterium y vectores de expresión de plantas apropiados, aumentar la concentración de Agrobacterium y prolongar el tiempo de infección, y agregar activadores del gen vir (como OH-AS, hemorragia dicotiledónea, etc.). Se ha logrado un gran avance en la transformación del trigo con Agrobacterium. ) cultivar* * y seleccionar genotipos, explantes y medios receptores apropiados.
En quinto lugar, el trigo en sí es un alohexaploide, con un genoma grande y complejo, y el silenciamiento y modificación de genes exógenos introducidos son más graves.
En sexto lugar, el papel de la excesiva dependencia de la evidencia biológica molecular del trigo genéticamente modificado. En cierto sentido, esto inhibe la aplicación del método de paso del tubo polínico en transgénicos de trigo.
6. Las perspectivas del trigo genéticamente modificado.
Con el establecimiento o establecimiento preliminar de múltiples sistemas de transformación genética para el trigo, la investigación transgénica del trigo progresará más rápidamente en los próximos cinco años. Pero este progreso se basará en el establecimiento y mejora de sistemas de regeneración de plantas más eficientes. La investigación transgénica basada en armas genéticas pasará a la investigación transgénica mediada por Agrobacterium, que optimizará o mejorará el sistema transgénico del trigo mediado por Agrobacterium. Al mismo tiempo, el trigo genéticamente modificado pasará de la etapa de investigación a la etapa de aplicación, por lo que un pequeño número de líneas o variedades de trigo genéticamente modificados entrarán en pruebas de campo o se lanzarán como líneas y variedades. El método de paso del tubo polínico, especialmente su combinación con Agrobacterium, será ampliamente aceptado y aplicado en la práctica transgénica del trigo. Madurarán varios métodos auxiliares mediados por Agrobacterium. Los genes de resistencia a los antibióticos, como genes de selección, básicamente desaparecerán en el trigo modificado genéticamente y serán reemplazados por diferentes genes de resistencia a herbicidas y diferentes genes de azúcar y hormonas. Los genes informadores obvios y beneficiosos, como los genes de antocianinas, se utilizarán ampliamente, por lo que la eficiencia de selección de los transformantes mejorará enormemente. Se introducirán y expresarán más genes de excelentes características agrícolas, especialmente genes que mejoran el valor nutricional de la harina, la calidad de las características del procesamiento de la harina, la resistencia de las plantas a las enfermedades, la resistencia a la sequía y la utilización eficiente del nitrógeno. Se utilizarán ampliamente promotores de mayor potencia y promotores específicos de órganos tisulares, también se utilizarán promotores químicamente controlables en algunos laboratorios avanzados y las tecnologías de inserción de copia única, como la "recombinación específica de sitio", serán más perfectas y su aplicación. Se mejorarán y utilizarán sistemas de esterilidad masculina genéticamente modificados en la producción de semillas híbridas. También se utilizarán genes de resistencia a herbicidas para controlar la pureza de los híbridos. Además, también tendremos una comprensión clara del sitio de inserción y el método de genes extraños, por lo que tendremos una comprensión más clara de la expresión y el silenciamiento de genes extraños. Al mismo tiempo, la tecnología de genes antisentido se utilizará inicialmente en la investigación de genes funcionales del trigo.
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1. Transformación genética de plantas
A finales de los años 1970 y principios de los años 1980, se utilizaron plásmidos Ri y Ti de tipo salvaje para transformar el tabaco y la patata. células, obtuvieron plantas regeneradas y luego establecieron una tecnología de transformación genética de plantas utilizando el plásmido Ti como vector. En los últimos años, la tecnología de transformación genética de plantas se ha desarrollado rápidamente y se han establecido muchos sistemas de transformación. Según el método de introducción de genes en células vegetales receptoras, la tecnología de transformación genética vegetal se puede dividir aproximadamente en dos categorías: transferencia de genes mediada por vectores y transferencia directa de genes o ADN. La llamada transferencia de genes mediada por vectores es una tecnología que conecta el gen objetivo con un ADN vectorial y luego transfiere el gen extraño a las células vegetales mediante infección del huésped y otros medios. La transferencia directa de ADN se refiere a una tecnología que utiliza las características biológicas de las células vegetales para transferir genes extraños a las células vegetales mediante métodos físicos, químicos y biológicos.
(1) La transformación de vectores mediada por Agrobacterium es el método de transformación de vectores más importante. El plásmido Agrobacterium Ti modificado se puede utilizar como vector para transferir eficazmente genes extraños. Existen dos métodos básicos para obtener plantas transformadas: uno es el método de cultivo * * * de Marton et al. El protoplasma vegetal se utiliza como receptor; uno es el cocultivo de discos foliares establecido por Horsch et al.
* * *El método de cultivo es un método de cocultivo de Agrobacterium y protoplastos de plantas para lograr la transformación. Los procedimientos incluyen la transformación de protoplastos de la pared celular primaria con Agrobacterium, la detección de células transformadas, la inducción de la diferenciación de las células transformadas y la regeneración de plantas.
El método del disco de hoja es en realidad un método de transformación creado mejorando el método de cultivo * * *. Infección de explantes de hojas con Agrobacterium y cultivo de corta duración. Durante el proceso de cultivo, se induce el gen vir de Agrobacterium y su activación puede iniciar la transferencia de ADN-T a las células vegetales. * * *Después del cultivo, se requieren pasos tales como seleccionar explantes transformados, cultivar callos, inducir la diferenciación y otros pasos para obtener plantas regeneradas. El método del disco foliar es un buen método para utilizar explantes de plantas como materiales transgénicos porque no requiere manipulación de protoplastos y es sencillo y rápido para obtener plantas transformadas.
La transformación genética mediada por Agrobacterium es un método común para transformar la mayoría de las plantas dicotiledóneas. Sin embargo, debido a la limitación del huésped de Agrobacterium, las plantas monocotiledóneas rara vez se infectan, especialmente algunos cultivos importantes como el arroz, el trigo y el maíz no son susceptibles a Agrobacterium, por lo que es difícil aplicar este método para la transformación genética.
Además de la transformación genética mencionada anteriormente utilizando el plásmido Ti como vector, también se pueden utilizar liposomas como vector para la transformación genética.
Los liposomas son estructuras similares a membranas compuestas de fosfolípidos, por lo que las moléculas de ADN pueden envolverse en liposomas para evitar la degradación por las enzimas del ADN en las células receptoras e introducirse en los protoplastos de las plantas.
(II) Métodos de transferencia directa de genes Se refiere a algunos métodos de transferencia de genes que no dependen de Agrobacterium u otros vectores o medios.
1. La estimulación eléctrica y la inyección eléctrica pueden cambiar la permeabilidad de las membranas celulares. El método de introducir ADN exógeno en los protoplastos de las plantas mediante estimulación eléctrica de pulsos eléctricos de alto voltaje se llama electroporación. Este método se ha utilizado ampliamente para la transferencia de genes en plantas y animales monocotiledóneas y dicotiledóneas. Por ejemplo, a finales de la década de 1980, este método se utilizó para transferir el gen de la neomicina fosfotransferasa (NPT) a protoplastos de una línea endogámica de maíz y regenerar las plantas.
El método de introducir genes directamente en células o tejidos vegetales intactos mediante tecnología de estimulación eléctrica se llama electroinyección. Este método evita las complejas operaciones y dificultades del cultivo de protoplastos y la regeneración de plantas, y tiene un gran potencial de aplicación.
2. Método de pistola genética El método de pistola genética también se denomina bombardeo de partículas. Este método utiliza una pistola de partículas para inyectar partículas metálicas con ADN extraño adsorbido en la superficie en células o tejidos vegetales a alta velocidad. Este método ha atraído mucha atención porque es rápido y simple, no está limitado por el rango de huéspedes, no requiere la eliminación de las paredes celulares de las células de la planta receptora, tiene una alta tasa de transformación y las células o tejidos transformados pueden regenerar plantas fácilmente. .
3. Método de microinyección La microinyección utiliza un microinyector para inyectar directamente genes extraños o ADN en el núcleo o citoplasma de la célula a través de medios mecánicos. En comparación con otros métodos, este método es más directo y eficaz a la hora de introducir material genético exógeno.
La microinyección no sólo se utiliza para células vegetales, en los últimos años se ha desarrollado para inyectar directamente el ovario de la planta, lo que favorece más la transformación del material genético exógeno en embriones inmaduros. Nuestro país comenzó a explorar teórica y prácticamente el trabajo en este campo en la década de 1970, y obtuvo plantas de algodón transformadas que son resistentes a la marchitez por fusarium y algodón resistente a los insectos.
2. La tecnología de los animales transgénicos y su aplicación
(1) El concepto de animales transgénicos es introducir genes extraños de interés en células germinales, células madre embrionarias y embriones tempranos mediante ingeniería genética. tecnología, e integrado de manera estable en el cromosoma receptor, obteniendo así individuos que pueden heredar el gen extraño de interés para las generaciones futuras a través de diversas vías de desarrollo, es decir, animales transgénicos. El gen diana transferido se llama transgén y el proceso de transferencia del gen diana se llama transgén. El concepto de "transgénico" suele limitarse a la transferencia de genes en animales y plantas mediante tecnología de ingeniería genética, por lo que la adquisición de nuevos genes mediante cruces sexuales o asexuales entre variedades no entra en esta categoría.
(2) Tecnología animal transgénica La tecnología animal transgénica es una biotecnología desarrollada a principios de la década de 1980 que supera el aislamiento reproductivo entre especies y realiza el intercambio y la recombinación de material genético entre especies animales. Dependiendo del método y objeto de la introducción de genes exógenos, existen tres formas principales de producir animales transgénicos: microinyección, retrovirus y células madre embrionarias. Los métodos básicos de transferencia de genes retrovirales se han presentado brevemente antes. Aquí solo presentamos dos métodos, el método de microinyección y el método de células madre embrionarias.
1. La tecnología de microinyección de pronúcleo en óvulos fecundados se desarrolló a partir de experimentos de transferencia nuclear en embriología animal. A principios de la década de 1980, la gente utilizó este método para transferir genes extraños a células germinales animales y establecer ratones transgénicos con éxito. En 1985 se introdujeron ovejas y cerdos genéticamente modificados. Desde entonces, ratones, conejos, gallinas, vacas, peces, etc. modificados genéticamente. Éxito tras éxito. Se puede observar que la microinyección es una tecnología ampliamente utilizada y más eficaz para la obtención de animales transgénicos.
Bajo un microscopio, se inserta directamente un tubo de vidrio con un diámetro de aproximadamente 1 μm en el pronúcleo masculino del óvulo fertilizado, el ADN del gen extraño en el tubo capilar se inyecta en el pronúcleo y luego se trasplanta. en la trompa de Falopio o el útero de la madre pseudoembarazada, se desarrollan hasta convertirse en descendencia. Para comprender la integración del transgén, se puede utilizar hibridación por transferencia puntual, reacción en cadena de la polimerasa o hibridación Southern para detectar el ADN de los individuos descendientes, según corresponda.
La ventaja del método de microinyección es que el fragmento del gen extraño introducido puede tener hasta 50 kb de largo y no requiere un vector, por lo que la tasa de integración del gen extraño en el cromosoma del huésped es relativamente alta. Su desventaja es que la integración de genes extraños es aleatoria, por lo que es difícil controlar su tasa de integración y si los genes extraños pueden integrarse de manera estable en el genoma receptor solo se puede determinar después de que nazca la descendencia, lo que no es propicio para la integración; crecimiento y producción durante el período de crecimiento. Aplicado a ganado grande con camada pequeña.
2. Las células madre embrionarias (ES) se refieren a células embrionarias indiferenciadas aisladas de la masa celular de la etapa de blastocisto de embriones de mamíferos. Tienen totipotencia de desarrollo y pueden diferenciarse en varios tipos de células. A mediados de la década de 1980, se empezaron a estudiar métodos para utilizar células ES para obtener animales transgénicos. Este método consiste en introducir genes extraños directamente en las células es y luego inyectarlos en la cavidad del blastocisto del receptor después del cribado in vitro, donde se agregarán con las células del blastocisto y pasarán a formar parte del embrión receptor, participando en su diferenciación. A partir de este embrión se desarrollan animales transgénicos con quimeras, es decir, algunos tejidos provienen de células ES de donantes que integran genes extraños. Durante el proceso de quimerismo, las células germinales diferenciadas de las células ES transformadas pueden transmitir los genes extraños introducidos mediante hibridación.
En la tecnología de obtención de animales transgénicos a partir de células madre embrionarias, se pueden introducir genes extraños en las células es de varias maneras. La identificación y el cribado de las células son convenientes, y el número de copias de los genes extraños se puede predeterminar. a nivel celular, niveles de localización y expresión, así como la estabilidad de la inserción, la operación de inyectar células ES en blastocistos es simple y la tasa de integración es relativamente alta. Pero el establecimiento de líneas de células ES en sí es una tarea muy ardua. Aunque se han establecido líneas celulares ES de ratón, aún no se han obtenido líneas celulares ES verdaderamente estables en cerdos y ovejas.
(3) Aplicación de los animales transgénicos La investigación sobre animales transgénicos es muy extensa. Desde los años 1980 y 1990, ha habido un gran desarrollo en profundidad y amplitud desde la teoría básica hasta la tecnología aplicada, pasando gradualmente del laboratorio a la práctica de producción.
1. Aplicación en el estudio de la regulación de la expresión génica Los animales transgénicos pueden utilizarse como "reactores" para estudiar la regulación de la expresión génica exógena in vivo. Aquí tomamos como ejemplos los elementos reguladores cis del ADN y la regulación espaciotemporal de los genes en desarrollo.
(1) Investigación sobre elementos reguladores cis Los niveles anormales de lipoproteínas están relacionados con enfermedades como la aterosclerosis. Hay cinco tipos de lipoproteínas en los humanos, cada una de las cuales contiene una apolipoproteína diferente. Se han descubierto unas 17 apolipoproteínas y se han secuenciado sus genes codificantes. Son genes candidatos para el estudio de enfermedades cardiovasculares. La transferencia del gen de la apolipoproteína a ratones se puede utilizar para estudiar el metabolismo, la regulación y la aterosclerosis de las lipoproteínas en humanos. Al estudiar los elementos reguladores en cis de la expresión tisular específica de genes de apolipoproteínas, se descubrieron dos grupos de expresión tisular específica de genes de apolipoproteínas (Figura 19-15). Un grupo que incluye los genes A-ⅰ, C-ⅲ y A-ⅳ está ubicado en las regiones 2 y 3 del cromosoma humano 11 (11q 23), compuesto en el orden de A-ⅰ, C-ⅲ y A-ⅳ. La dirección de transcripción de C-ⅲ es opuesta a la de los otros dos genes. A-ⅰ y C-ⅲ se expresan principalmente en el hígado y el intestino delgado, y A-ⅳ se expresa principalmente en el intestino delgado. El rango de -0,2 ~ -1,4 BP del gen C-ⅲ es la región que regula la expresión del gen A-ⅰ en el intestino delgado. Esta región también es un elemento regulador para la expresión de los genes C-ⅲ y A-ⅳ en el intestino delgado, lo que indica que este elemento puede regular la expresión de todo el grupo de genes de apolipoproteínas en el intestino delgado. Otro grupo de genes está ubicado en la región del brazo largo 3 del cromosoma 19 (19q13), que contiene los genes E, C-I y C-II, dispuestos en el orden de E, C-I y C-II. El gen e se expresa principalmente en el hígado y en la mayoría de los tejidos del cuerpo, pero el nivel de expresión es bajo. Posteriormente se descubrió que había una brecha entre el gen C-ⅰ y el gen C-ⅱ.