¿Cuáles son los métodos para clonar genes diana de organismos?
El método de clonación por amplificación por PCR es un método de clonación de secuencias de genes basado en secuencias de genes de plantas conocidas. Primero, se encuentra la secuencia genética relevante en la biblioteca de genes y luego se sintetiza un par de cebadores oligonucleotídicos. El ADN o ARN cromosómico se extrae de las plantas y se amplifica mediante PCR. Los fragmentos amplificados se purifican y se insertan en vectores plasmídicos apropiados. Realice un análisis de digestión con enzimas de restricción y un análisis de secuencia en el recombinante y compárelo con la secuencia del gen conocido para obtener el gen objetivo.
2. Método de clonación funcional
La clonación funcional se realiza en base a las características bioquímicas básicas del rasgo tras determinar la función del gen conocido. Este método construye una biblioteca de ADNc o una biblioteca de genoma después de purificar la proteína codificada correspondiente. Luego, se seleccionaron genes de la biblioteca utilizando dos métodos. Una es secuenciar los aminoácidos de proteínas purificadas y luego sintetizar sondas de oligonucleótidos para seleccionar genes codificantes de bibliotecas de ADNc o bibliotecas genómicas. En segundo lugar, la proteína se convierte en la sonda de anticuerpo correspondiente y los clones correspondientes se seleccionan a partir de la biblioteca de expresión del vector de ADNc. Un paso clave en la clonación funcional es el aislamiento de proteínas de alta pureza. Este método no puede clonar genes cuyos productos se desconocen.
3. Método de clonación por posición (posición del mapa)
La clonación posicional se basa en la posición del gen objetivo en el cromosoma y luego se clona mediante el recorrido cromosómico. Es necesario establecer de antemano una población de segregación genética adecuada (línea casi isogénica o población de segregación) con el gen objetivo, localizar con precisión el gen objetivo en una posición específica del cromosoma y utilizar marcadores moleculares estrechamente vinculados (marcadores RFLP) en ambos lados del gen objetivo como sondas examinan la biblioteca genómica, luego usan los extremos de los clones positivos como sondas para obtener clones grandes que contienen el gen objetivo y luego usan estos nuevos ADN como sondas para obtener fragmentos de ADN que están más cerca del gen objetivo. gen diana, lo que reduce continuamente el alcance del cribado.
4. Método de etiquetado de transposones
Los transposones son fragmentos de ADN que se pueden transferir de una posición de un gen a otra posición del gen, pero el fragmento de ADN original (transposón) no desaparece, sólo Se transfieren copias del transposón. La transposición de genes puede provocar mutaciones de inserción, inactivando el gen en la posición de inserción e induciendo mutaciones. La ubicación del gen mutado se puede detectar marcando el gen y luego se puede clonar el gen mutado. De esta manera, las etiquetas de transposones se denominan etiquetas de transposones. Los transposones se utilizan como marcadores para el posicionamiento de genes y los genes se clonan mediante la inserción de transposones y el quimerismo en el cromosoma. para & gt5. Hibridación sustractiva
Este método clona genes de plantas basándose en diferencias en el fenotipo de la planta o diferencias en la expresión genética en diferentes tejidos u órganos. Los genes expresados específicamente tienen diferentes expresiones de ARNm. El ARNm se extrae de tejidos vegetales que expresan genes específicos y de tejidos que no expresan genes específicos, se transcribe de forma inversa en ADNc y los dos se hibridan. Los productos génicos expresados en ambos tejidos forman moléculas híbridas, mientras que el ADNc transcrito a partir de un ARNm específico permanece monocatenario. El aislamiento de este ADNc monocatenario es un gen expresado diferencialmente. Esta estrategia se llama hibridación sustractiva.
6. Método de visualización diferencial de ARNm
Este método puede identificar y clonar eficazmente genes expresados diferencialmente. Después de extraer diferentes ARNm, utilice los mismos cebadores para transcribirlos de forma inversa en ADNc y luego amplificarlos mediante PCR para obtener secuencias de ADNc expresadas diferencialmente, que pueden usarse como sondas para detectar genes en bibliotecas de ADNc o bibliotecas de genoma y realizar análisis funcionales. Este método puede detectar directamente genes expresados diferencialmente, lo cual es más conveniente y rápido que la hibridación sustractiva. Requiere menos ARN total y es muy eficiente. Puede completar la amplificación, identificación y clonación del ADNc en poco tiempo.