¿Cuál de los siguientes métodos se utiliza actualmente para detectar cnv?
CNV está ampliamente distribuido en el genoma humano y es uno de los factores causantes importantes de enfermedades humanas. La CNV patógena puede causar retraso mental, retraso del crecimiento, autismo, diversos defectos de nacimiento, leucemia y tumores. Actualmente, los principales métodos para detectar CNV incluyen aCGH, SNP-array, CNV-seq, MLPA, etc. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de cada uno de estos métodos y cómo debería elegir?
Método de detección 1: aCGH
La ACGH también se denomina hibridación genómica comparativa basada en matrices.
Principio: Cantidades iguales de ADN a analizar y ADN de control normal se marcan con tintes fluorescentes rojo y verde respectivamente y luego se mezclan para competir con el chip de ADN del genoma completo para la hibridación. Después de escanear con láser el chip híbrido, se compara la intensidad luminosa de la luz roja y la luz verde en cada punto. Si la luz roja es demasiado fuerte, significa que el número de copia de la muestra a analizar está duplicado; si la luz roja es débil, significa que falta el número de copia de la muestra a analizar; son iguales, significa que el número de copias de la muestra a analizar es normal.
Aplicación: La CNV se puede detectar a nivel de todo el genoma.
Comentario: La resolución de aCGH depende de la densidad y longitud de las sondas a lo largo del genoma. En el chip de microarray CGH humano Agilent sureprint G3 de 1x1 m, el espacio entre sondas es de aproximadamente 2 kb. Debido a que el cambio en la intensidad de la fluorescencia desde un punto puede tener un cierto grado de probabilidad, generalmente es necesario observar tres puntos (o múltiples puntos) adyacentes entre sí en el espacio cromosómico. Si las proporciones de fluorescencia de estos tres puntos se desvían en la misma dirección, hay evidencia de variación en el número de copias en el segmento. Con base en esta consideración, la resolución de aCGH es de aproximadamente 6 kb según tres puntos.
Método de detección 2: matriz de SNP
SNP (polimorfismo de un solo nucleótido) se refiere al polimorfismo de la secuencia de ADN causado por la variación de un solo nucleótido a nivel del genoma. Los SNP están ampliamente presentes en el genoma humano, con un promedio de 1 SNP por cada 500-1000 pares de bases, y hay aproximadamente 3 millones de SNP en los 3 mil millones de pares de bases de los seres humanos.
Principio: a diferencia de la estrategia de dos híbridos utilizada por aCGH, la matriz SNP utiliza la muestra que se va a analizar y la sonda del chip para hibridar, y determina el número de copias de cada locus comparando la intensidad de la señal de diferentes muestras.
Aplicación: La sonda del chip SNP es la secuencia del sitio SNP, que puede proporcionar información de SNP. Además de CNV, puede detectar diploidía partenogenética (UPD), pérdida de heterocigosidad (LOH) y mosaicismo.
Comentarios: Las sondas de chip SNP tienen muy alta densidad y alta resolución en todo el genoma. Sin embargo, estas sondas no están distribuidas uniformemente por todo el genoma. En algunas secuencias repetitivas y regiones CNV complejas, la densidad de SNP es pequeña y no se puede obtener un mapa CNV claro. Affymetrix e Illumina han agregado sondas no polimórficas a sus chips de nueva generación, que pueden ubicar mejor las sondas en áreas específicas y mejorar la claridad del mapa. Actualmente, el chip CytoScan HD de Affymetrix tiene la densidad de sonda más alta, que contiene 2,7 millones de sondas, con un espacio promedio entre sondas entre genes de 1 kb. Según estos tres puntos, la resolución de la matriz SNP es de aproximadamente 3 kb.
Detección de eventos de duplicación alélica en genomas haploides
Se muestran tetraploides, triploides, diploides y haploides respectivamente.
Método de detección 3: secuencia CNV
seq es una tecnología de secuenciación del genoma completo de baja potencia para la detección de CNV desarrollada y propuesta por Xie [1] et al.
Principio: El principio de detección de CNV-seq es similar al de aCGH. Se secuenciaron por separado la misma cantidad de ADN de muestra y ADN de control normal y se compararon con la secuencia de referencia. El número de copias de cada locus se determinó comparando las lecturas alineadas en cada ventana deslizante de las dos muestras.
Aplicación: Puede detectar grandes fragmentos de CNV a nivel del genoma completo.
Comentario: Berry y Kang adoptan un diseño experimental doble ciego para detectar muestras con estructura cromosómica anormal. Cuando el tamaño de la ventana deslizante es de 20 kb, tanto las secuencias de CNV como los conjuntos de SNP de alta densidad pueden detectar el 65,438+0,000% de las CNV patógenas conocidas [2]. CNV-seq funciona mejor en comparación con la matriz SNP de densidad media. En vista del bajo precio de las secuencias de CNV, las secuencias de CNV pueden reemplazar los chips de microarrays para la detección de CNV de fragmentos grandes. La resolución de las secuencias CNV depende del tamaño de la ventana deslizante. En términos generales, si se trata de una secuenciación del genoma de baja potencia, la ventana deslizante no puede ser demasiado pequeña para que el número de lecturas en la ventana deslizante sea creíble. Como se describe en el artículo 2, la resolución de las secuencias CNV es de aproximadamente 60 kb según un tamaño de ventana deslizante de 20 kb y tres puntos.
Comparación de aCGH y secuencia de detección de CNV de CNV.
Método de detección 4: MLPA
MLPA (Amplificación de sonda dependiente de ligadura múltiple, amplificación de sonda dependiente de ligadura múltiple) fue propuesta por primera vez por el académico holandés Dr. SchoutenJP en 2002. Es a Una tecnología para el análisis cualitativo y semicuantitativo de secuencias diana de ADN que se van a probar.
Principio: Diseñar un par de sondas MLPA en ambos lados de un sitio de mutación específico (como una mutación puntual) en la secuencia objetivo del ADN. Cada sonda contiene una secuencia de cebador universal y una secuencia de hibridación específica. Después de la hibridación entre la secuencia de hibridación y la secuencia diana, las dos sondas se ligan en una única cadena de nucleótidos usando ligasa y luego se realiza la amplificación por PCR usando cebadores universales. Comparando la cantidad de producto de PCR entre el ADN que se va a analizar y el ADN de control normal, se puede determinar el número de copias de la secuencia diana de ADN de la muestra que se va a analizar. Vale la pena señalar que las ligasas son muy exigentes. Sólo cuando la sonda y las secuencias diana son completamente complementarias en el sitio de detección, la ligasa puede conectar con éxito las dos sondas en una sola hebra para su posterior amplificación. Si existen metilación, mutaciones puntuales y CNV en el sitio de detección, la conexión de la sonda falla y no se puede realizar la amplificación por PCR posterior.
Aplicación: Validación de mutaciones puntuales, metilación y CNVs en genes específicos con alta sospecha.
Comentarios: Esta tecnología es rápida y muy específica, pero no puede realizar un análisis global del genoma. Se pueden detectar simultáneamente cambios en el número de copias de 40 secuencias de nucleótidos diferentes en un solo tubo de reacción.