La fuente de interpretación de la literatura y la edición genética de las células THP-1 ayudan a revelar el mecanismo del factor proinflamatorio CypA
Dado que las citocinas desempeñan un papel importante en la respuesta inflamatoria, para detectar la expresión de estas citocinas en el modelo inflamatorio, los autores recolectaron líquido de lavado pulmonar y broncoalveolar de ratones Ppia -/- y WT (BALF). ) y suero, la citocina pulmonar Il1b se detectó mediante qPCR, ELISA y experimentos de inmunohistoquímica (Figura 1E). y los niveles de expresión de la citocina IL-1β secretada en BALF (Fig. 1F), suero (Fig. 1G) y pulmón (Fig. 1H y Fig. 1I). Se descubrió que los niveles de expresión de estas dos citocinas en diferentes partes de ratones WT eran a las 6 h, 12 h y 24 h. Además, los autores también examinaron los niveles de expresión de otras citoquinas en diferentes sitios. En resumen, todos los resultados experimentales indican que CypA controla principalmente los efectos de la IL-1β en diferentes etapas de la inflamación en el modelo de ratón con inflamación inducida por LPS.
Para determinar mejor por qué CypA puede promover la expresión de IL-1β en la etapa temprana de la inflamación, primero aprendimos de la literatura que CypA puede promover la producción de citoquinas proinflamatorias al regular p65 en NF-κB El autor aquí Líneas celulares primarias de ratón clásicas: macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM), línea celular de cáncer de pulmón de células no pequeñas humana A549 y línea celular clásica humana THP-1 (THP-1/p pia-/). -? (células ?) proporcionadas por el pocillo fuente), se obtuvieron las líneas celulares knockout o mutantes knockout PPIA correspondientes mediante CRIPR-Cas9 e interferencia. Posteriormente, estas líneas celulares WT y mutantes se trataron con LPS para simular neumonía, y se detectaron y compararon los niveles de expresión de ARNm de las citoquinas Il1b o IL1B detectadas en el modelo de ratón a las 0, 2, 4, 6 y 8 h, respectivamente. (Figuras S2a-c). Los niveles de expresión de proteínas de CypA y pro-IL-1β a las 0, 4 h, 8 h y 12 h (Fig. S2D-F), y los niveles de expresión de p65 fosforilada a las 0, 15 min, 30 min y 60 min (Fig. .S2G-I). Por lo tanto, CypA puede aumentar la expresión de Il1b e IL1B y el contenido de pro-IL-1β al aumentar el nivel de fosforilación de p65. Para determinar más a fondo cómo CypA promueve la expresión de IL-1β, los autores mutaron el dominio de actividad de la enzima PPI de CypA (R55A) y detectaron los mismos componentes que la línea celular knockout de PPI (S2J-L), lo que demuestra que, excepto por los mismos resultados, lo que indica que la mejora de la expresión de IL-1β mediada por CypA requiere su enzima en las primeras etapas de la inflamación.
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Según resultados de investigaciones anteriores, la IL-1β inicialmente funcionó como una citocina inactiva ( pro-IL-1β) sintetizada. Una vez que se activa la señalización secundaria, NLRP 3/ASC/Caspasa-1β escinde la pro-IL-1β en IL-1 activa. Por lo tanto, los autores investigaron más a fondo si CypA afecta el procesamiento de pro-IL-1β.
Primero, a través de experimentos ELISA en los modelos BMDM/Ppia -/- (Figura 2A), THP-1/P PIA -/- (Figura 3A) y A549/CypA- (Figura 3B), sabemos que cuando el ATP estimula la inflamación, el Cuando se activó, la expresión de IL-1β en líneas celulares mutantes CypA se redujo significativamente.
(El efecto inhibidor de CypA sobre la inflamación inducida por LPS.
Se informa que sin la estimulación de señales secundarias como el ATP, el procesamiento y la liberación de IL-1β son ineficientes Y la mayoría de los productos sintetizados permanecen en las células, sin procesar o degradados. Para explorar por qué CypA puede inhibir la expresión de IL-1β en la etapa tardía de la inflamación, los autores estudiaron el efecto de CypA sobre la estabilidad de. Precursor de IL-1β Los niveles de expresión de BMDM/Ppia -/- (Figura 2B), THP-1/P PIA -/- (Figura S3C), 293T/CypA- y pro-IL-1β en el modelo se detectaron directamente. mediante transferencia Western los resultados mostraron que CypA. Los tres tipos de células WT tuvieron un efecto promotor. Posteriormente, el vector de expresión pro-IL-1β marcado con FLAG se transfectó en 293T y se trató con DMSO, MG132 y NH4Cl (Figura 2C). La degradación de 1β indica que la pro-IL-1β puede degradarse.
(3) CypA afecta la ubiquitinación de pro-IL-1β.
Se informa que sí. relacionado con la ubiquitinación. K63 unido a pro-IL-1β juega un papel importante en la activación del inflamasoma y la secreción de IL-1β. Por lo tanto, para verificar si CypA afecta la ubiquitinación de pro-IL-1β, los autores realizaron la ubiquitinación. Los experimentos con el método de transferencia Western encontraron que CypA tenía un efecto significativo en la ubiquitinación ligada a pro-IL-1β K48 en ausencia de estimulación con ATP (Figura 2D, Figura S3F), pero cuando se usó ATP (4). ) Verificación de sitios clave de ubiquitinación de Pro-IL-1β
Para verificar aún más los sitios clave de ubiquitinación de pro-IL-1β, se descubrieron tres sitios potenciales de ubiquitinación mediante análisis de espectrometría de masas en el lugar de ubiquitinación. los sitios K73, K132 y K143 muestran que las mutaciones K73R, K132R y K143R conducen a una ubiquitinación reducida de pre-IL-1β ligada a K48, mientras que las mutaciones K132R y K143R conducen a K63 de pre-IL-1β. No estaba claro cuál era el punto crítico. sitio de ubiquitinación para el procesamiento de pro-IL-1β. Por lo tanto, los autores transfectaron células 293T con NLRP3, ASC, caspasa-1 y pro-IL-1β de tipo salvaje o mutante *** mediante estimulación de ATP (Figura 2G). ) y experimentos ELISA (Figura 2H), se encontró que la mutación K143R bloqueaba pro-IL-65433. Posteriormente, se detectó nuevamente pro-IL-1b-myc de tipo salvaje y sus diferencias mediante transferencia Western 293T del gen mutante.
En conjunto, estos datos indican que se producen altas concentraciones de ATP durante la fase de activación de la inflamación. Bajo estimulación, CypA promueve el procesamiento de pro-IL-1β principalmente mejorando la ubiquitinación ligada a K63 en el sitio K143. Durante la fase de remisión de la inflamación, CypA acelera principalmente la degradación de pro-IL-1β al promover la ubiquitinación de K48 en los sitios K132 y K143 en un entorno de ATP de baja concentración.
Por supuesto, la investigación del autor no termina ahí. Posteriormente, mediante un cuidadoso diseño experimental y comparación, el modelo de inflamación inducida por IL-1β se estudió de manera más sistemática, revelando el mecanismo por el cual CypA agrava la inflamación inducida por IL-1β y aclarando el papel de CypA en la reparación pulmonar inducida por IL-1β. .