Quiero producir uroquinasa, por favor ayuda, ¡gracias!
La uroquinasa es un fármaco bioquímico extraído de la orina masculina. Se utiliza ampliamente en el tratamiento de la enfermedad oclusiva trombótica reciente, la embolia pulmonar, la trombosis cerebral aguda, la embolia vascular cerebral y la trombosis de la vena central de la retina. Debido a la gran población de nuestro país, sus abundantes recursos y sus bajos costos laborales, la producción de uroquinasa cruda se extiende por todo el país. Entre los productos crudos de uroquinasa producidos, sólo una parte se refina para convertirlos en productos de alta calidad para la exportación, mientras que muchos productos crudos se exportan directamente, lo que permite a los empresarios extranjeros obtener grandes ganancias. Estudiar la tecnología y los métodos de purificación de uroquinasa y mejorar el rendimiento de uroquinasa en cada proceso durante el proceso de purificación, mejorar el alto valor agregado de los productos de uroquinasa, utilizar recursos renovables, ganar divisas a través de la exportación, beneficiar al país y al pueblo, y tener importantes beneficios e importancia económicos y sociales.
1. Materiales principales
Uroquinasa cruda (producida mediante el método del gel de sílice), glicina (C·P), ácido sulfúrico (A·R), hidróxido de sodio (A·R) , Ácido clorhídrico
(A·R), dihidrógenofosfato de sodio (C·P), hidrogenofosfato disódico, azida sódica (A·R), resina 714, CM-S.
II. Proceso de prueba y condiciones técnicas
(1) Análisis
1. Tomar 200 gramos de uroquinasa cruda (medida, la actividad específica es 325 iu/mgP). ), suspendido en 8 veces el importe. En tampón de glicina SM, la concentración de uroquinasa es 4500 UI/ml, se mantiene una temperatura baja, se agita durante 75 minutos, se deja reposar durante 45 minutos y el sobrenadante se separa del sedimento del fondo mediante sifón.
2. Agregue 1 vez la cantidad de tampón de glicina al precipitado después de extraer el sobrenadante. Trate como se indicó anteriormente y tome el sobrenadante.
3. SNH:50 a baja temperatura para ajustar el pH. erudito. .1 (Muestreo y determinación de precio).
(2) Decoloración de resina 714
1. Según la potencia de la solución analítica por 100 millones de unidades, coloque 1,4 kg de resina. la columna y lavar la resina con agua destilada durante varios segundos. El volumen del lecho estará disponible más tarde.
2. Cambiar PH10·. Cargue la solución analítica en la columna y controle el caudal a 1,8 ~ 2,oml/cmZ min. Recoja el efluente. Después de cargar la columna, lave la columna con un volumen de lecho de agua destilada a baja temperatura.
3. Combine los efluentes de la columna. Utilice sNHZSO' para ajustar el pH a 10,0 ± 0,1.
(3) Tratamiento de ultrafiltración
1. El líquido decolorado se desaliniza mediante ultrafiltración y se concentra hasta aproximadamente una sexta parte del volumen original mediante ultrafiltración.
2. Añadir agua destilada a baja temperatura a la solución concentrada y diluirla hasta una conductividad de 4,smV (10°C).
3. Concentrar nuevamente a una sexta parte del volumen.
4. Añadir baja temperatura al líquido concentrado secundario. .18M, tampón fosfato PH6.8 y agua destilada se diluyen hasta el volumen original. La proporción entre ambos debe ser tal que la conductividad de la solución diluida sea de 4,8 ± 0,lmV (a 10°C).
5. Luego use SNHZSO para ajustar el pH a 6,8 ± 0,1.
6. Calibre la conductancia nuevamente a 4,8±. .lmV(10℃).
(4) Purificación del gel de intercambio CM-S (realizada a baja temperatura)
1.Pretratamiento CM-S: después de remojar CM-S en agua destilada, use Tratar con NaOH y HCL, luego se equilibra con tampón fosfato PH6.8 0,18 M y se filtra el CM-S equilibrado se suspende en tampón fosfato PH6.8 0,18 M que contiene NaN al 0,08 %: Refrigere a temperatura media o baja.
2.Adsorción de CM-S
(1) Después de la ultrafiltración de la solución de ácido úrico con pH 6,8 y conductividad de 4,smV, agregue CM-S equilibrado a skg/100 millones de unidades. . S, revuelva durante dos horas para evitar la formación de espuma, déjelo reposar durante una hora y extraiga el sobrenadante.
(2) Coloque el CM-S que adsorbe la uroquinasa en la columna de vidrio orgánico para evitar la formación de espuma en la columna y suavizar la superficie de la columna.
3.
(1) Después de cargar CM-S en la columna, se lava con tampón de fosfato que contiene 0,3 % de NaN3, pH 6,8 y 0,18 M. El caudal es de 1,8~
(2) Utilice 1. Tampón de fosfato SMPH6.8 para lavar la mitad del volumen del lecho. El caudal permanece sin cambios y el pico de absorción de 280 nm del efluente debe caer por debajo de 0,03.
4. Elución del ácido urinario
(1) Después del lavado, utilice 0,08 MP, hidrogenofosfato disódico H8.8 y tampón de bicarbonato de sodio 0,95 M para eluir, caudal. 0,4 ml/cm2, mida la potencia y el pico de absorción de 280 nm del efluente y combine los efluentes activos para que la concentración de la solución mezclada sea superior a 500 in/ml.
(2) Ajustar el pH de la solución mezclada a 6. ~7.0 Después de tomar la muestra para la prueba, colóquela en una botella de plástico de dos litros, congélela rápidamente con hielo seco y guárdela a una temperatura baja, inferior a 22 °C.
(5) Determinación de la potencia y actividad específica del ácido urinario [Reino Unido]
1 Principio de la prueba
(1) Reactivos y equipos principales
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Baño de agua a temperatura constante, despertador graduado, lámpara fluorescente, papel cuadriculado de títulos del Reino Unido, trombina bovina (T), plasminógeno bovino (PG), fibrina bovina (FG), estándar del Reino Unido, Barbiton Na, Trio. , NaZEDTA, Nael
(2) Preparación del reactivo
T: Trombina bovina 40BP (Instituto de Productos Farmacéuticos y Biológicos, Ministerio de Salud), agregar 6,6 ml de tampón Barbiton-Na a cada uno tubo.
PG: Plasminógeno bovino 22BP (Instituto de Medicamentos y Productos Biológicos, Ministerio de Salud), añadir 24ml de tampón Tris a cada tubo.
PG-T: Mezclar volúmenes iguales de PG6.6nil y la 6.T resistente preparada, introducir en un Erlenmeyer al 50%, cerrar la boca y reservar.
FG: Comprimido de fibrinógeno, 12sBP (Instituto de Productos Farmacéuticos y Biológicos, Ministerio de Sanidad), añadir 18ml de tampón Barbiton-Na
a cada tubo.
(3) Dilución estándar del Reino Unido
Diluir el estándar (100 UI/tubo) con solución de barbitúricos a 60 pulgadas/ml.
(4) Dibujar la curva estándar
① Tome 4 tubos de ensayo a las 5 en punto, márquelos y agregue resistencia FGO.3 respectivamente
②; Agregue el estándar de dilución respectivamente solución UK 0.4, 0.3, 0.2, 0.lmbu
③Agregue solución de barbitúricos 0.6, 0.7, 0.3, 0.9 veces respectivamente;
④Agregue 0.4ml de PG-T respectivamente Agite bien, póngalo inmediatamente en una olla con agua a temperatura constante a 37 °C y registre el tiempo;
⑤Observe el aumento de las burbujas y registre el tiempo de finalización cuando el volumen sea la mitad;
⑥Utilice la potencia unitaria como abscisa, el tiempo es la ordenada y para dibujar una curva estándar se requieren al menos tres puntos en una línea recta.
(5) Detección de muestras
①Después de la curva estándar, realice la detección de muestras en las mismas condiciones y con el mismo reactivo;
②Agregue FGO por separado, 0,3 ml de barbitúrico buffer 0.gml, PG-TO.4mh
③Los pasos restantes son los mismos que antes.
(6) Mida el valor D.O.
Diluya la muestra después de agregar ácido 10 veces y luego mida el valor D.O.
(7) Calcular la potencia y la actividad específica
①De acuerdo con el tiempo de subida de la burbuja de la muestra de prueba, encuentre la potencia del punto correspondiente en la curva estándar y multiplíquela por 20 para obtener muestra
Potencia real.
②Potencia total~potencia unitaria (iu/mDxvolumen total (ml)
③Actividad específica~potencia media xl.75/0·D
2. Determinación de rendimiento del producto y actividad específica
①Se midieron la potencia total y la actividad específica de la solución analítica. Los resultados son los siguientes:
Potencia total: 24,89 millones de unidades, actividad específica: 325 iu/. mgP
②Potencia total y actividad específica después de la purificación
Potencia total: 10,82 millones de unidades Actividad específica: "660iu/mgP
③Rendimiento refinado: 41%
3. Discusión
1. La uroquinasa generalmente existe en dos formas moleculares, a saber, peso molecular 36 y actividad de uroquinasa de peso molecular grande.
La actividad de las moléculas más pequeñas. La uroquinasa de peso molecular pequeño es mucho más fuerte para aumentar la actividad específica, una es eliminar las proteínas impurezas y la otra es eliminar la uroquinasa de peso molecular pequeño aislada que se puede recuperar y purificar por separado.
2. Como principio activo se debe tomar uroquinasa para evitar su inactivación durante el proceso de purificación. Durante el proceso de investigación, primero dominamos los pasos para medir la potencia y la actividad específica de la uroquinasa, y luego cambiamos constantemente las condiciones de operación para determinar el impacto de la uroquinasa en cada proceso. Investigamos factores para mejorar el rendimiento y la actividad específica, y gradualmente encontramos. las mejores condiciones técnicas.
3. Las aguas madre después de la adsorción de CM-S y la parte del eluato de CM-S con un título superior a 200 iu/ml deben someterse a análisis de sal de ultrafiltración y recuperación, que se puede utilizar para la alimentación de producto crudo.
La orina masculina utilizada para extraer la uroquinasa tiene un valor de pH <6,5, una conductividad de 20~3OMO-' y un recuento bacteriano total de <1000
/ml, y es oxidado con hidrógeno 3 N Ajustar el pH a 8,5-9 con sodio Después de agregar diatomita para adsorber y precipitar, filtrar la diatomita, agitar y lavar con agua limpia, centrifugar y poner en la columna de intercambio, enjuagar con agua con amoníaco, agregar. ácido fosfórico saturado al eluato disódico, ajustar el pH a 8,0, añadir cloruro sódico para ajustar la conductividad a 22Mn, pasarlo a través de la columna de cromatografía de polisacáridos reticulados de etilo cuaternario, luego eluir con tampón fosfato, combinar el efluente y eluir, Agregue ácido acético para ajustar el pH a -4,2, ajuste la conductividad a 16~17Mn-', páselo a través de una columna de cromatografía de metilcelulosa, eluya con agua con amoníaco, recoja el eluato, agregue agua para diálisis y liofilice en una centrífuga. para obtener el producto terminado de uroquinasa. Lo que se obtiene anteriormente es sólo uroquinasa cruda, que también puede modificarse y refinarse con dextrosa, heparina, albúmina sérica humana, etc. para mejorar su estabilidad bioquímica y extender su tiempo de acción en el cuerpo humano. Además de utilizar el método de separación anterior para preparar uroquinasa, también se puede utilizar el método de degradación de proteasa neutra para preparar uroquinasa. En países extranjeros, la recombinación de ADN también se utiliza para cultivar prouroquinasa en E. coli. Mientras se extrae la uroquinasa, la orina restante también se puede utilizar para extraer albúmina en orina humana.
La uroquinasa es una proteasa alcalina que no tiene antigenicidad, toxicidad ni otros efectos secundarios, y se puede utilizar clínicamente para la embolia pulmonar y la enfermedad coronaria. enfermedad cardíaca, trombosis cerebral, infarto de miocardio, opacidad vítrea, hemorragia del fondo de ojo, hematoma intracraneal, embolia venosa y glomerulonefritis aguda (crónica) y otras enfermedades, y también se puede utilizar para tratar la fibrinosis causada por enfermedades y se puede utilizar como fármaco auxiliar. contra el cáncer. Además, la uroquinasa también se puede utilizar para desarrollar bebidas saludables, bebidas espaciales y cosméticos. Como empresa municipal, el desarrollo de productos de uroquinasa no solo requiere baja inversión, alta eficiencia, bajo consumo de energía, materias primas fáciles de obtener, procesos simples, no tóxicos, inofensivos y libres de contaminación, sino que también merece una fuerte promoción. .