¿Quién conoce los pasos detallados del cultivo celular?

El cultivo celular aislado primario se refiere a la separación de tejidos de donantes en células individuales o grupos de células individuales mediante maquinaria y digestión, de modo que puedan simular el entorno fisiológico humano in vitro y sobrevivir, crecer y reproducirse en condiciones estériles y adecuadas de temperatura y en determinadas condiciones nutricionales. . Las células cultivadas primarias suelen tener diferentes componentes celulares y crecen lentamente, pero son más representativas de los tipos de células del tejido y expresan las características específicas del tejido. El uso del cultivo celular primario para diversos experimentos, como pruebas de fármacos, diferenciación celular, virología, etc., ha logrado buenos resultados. Los pasos son los siguientes.

1. Cortar el tejido. Primero, limpie el tejido obtenido con solución D-Hanks o Hanks para eliminar las manchas de sangre en la superficie y luego use pinzas quirúrgicas para eliminar el tejido conectivo adherido y otros tejidos que no requieren cultivo. Después de lavarlo nuevamente, use un bisturí para cortar el tejido en varios trozos pequeños, muévalo a un vial o vaso de precipitados de penicilina, agregue una cantidad adecuada de tampón y use un ojo en forma de codo para cortar repetidamente con tijeras hasta que el tejido se convierta en una pasta. con un tamaño de aproximadamente 1 mm3. Después de reposar por un período de tiempo, use una pipeta para drenar el líquido superior, agregue el tampón apropiado y lave nuevamente.

2. Digestión y separación El propósito de la digestión y separación es digerir y separar pequeños bloques de tejido en grupos de células o células individuales dispersas para su posterior cultivo. Las enzimas digestivas de uso común incluyen tripsina y colagenasa.

3. Utilice una tabla de conteo para contar la suspensión de células cultivadas. Utilice medio de cultivo para ajustar el número de células a (2 ~ 5) × 105 células/ml, o la densidad requerida para el experimento, y distribúyalo en frascos de cultivo de modo que el volumen de suspensión celular después de tapar sea ligeramente superior al del fondo. del frasco de cultivo. Colocar en una incubadora de CO2, 5% de CO2 y cultivar a 37°C. En términos generales, las células cultivadas primarias pueden adherirse a la pared de la botella en 3 a 5 días y comenzar a crecer después del estiramiento. Se puede agregar medio nuevo con un volumen de la mitad del medio original y el medio se puede reemplazar después de 2 a 3 días de cultivo continuo. Generalmente, la pared de la botella puede crecer después de 7 a 14 días de subcultivo.

4. Medidas preventivas

(1) Operación aséptica: La contaminación bacteriana o por moho es una causa común de falla del cultivo, por lo que se debe fortalecer el concepto de operación aséptica en todos los aspectos, centrándose sobre prevención. Una vez contaminado, generalmente es difícil eliminarlo.

(2) Medio: El medio utilizado debe cumplir las condiciones necesarias para la supervivencia y crecimiento celular. Debido a las diferentes especies animales y tipos de tejidos de los que se derivan las células, existen ciertas diferencias en los requisitos de los medios de cultivo. Si es necesario, se puede seleccionar un medio de cultivo adecuado mediante experimentos preliminares.

(3) Suero de ternera: El suero de ternera desempeña un papel clave en el mantenimiento de la supervivencia de las células cultivadas y en la promoción de la proliferación celular. Se pueden seleccionar muchos lotes diferentes de suero de ternera para el análisis de muestras pequeñas. Una vez que se determina un lote de suero de ternera de un determinado fabricante, se utilizará hasta el final del experimento.

(4) Solución de colagenasa: debe prepararse recién. El almacenamiento prolongado (incluso a una temperatura baja de -20 °C) afectará la eficiencia de la digestión, lo que provocará un tiempo de digestión prolongado y un daño celular agravado. .

(5)L-Glutamina: Casi todas las células tienen altos requerimientos de glutamina. Las células necesitan glutamina para sintetizar ácidos nucleicos y proteínas. Sin glutamina, las células morirán debido a un crecimiento deficiente. La glutamina es muy inestable en solución. Cuando el medio de cultivo que contiene glutamina se almacena en un refrigerador a 4°C durante más de dos semanas, se debe agregar nuevamente la cantidad original de glutamina.

(6) Cultivo estático: Una vez digeridas y separadas las células primarias, se deben colocar en una incubadora de CO2 durante las primeras 24 a 48 horas (72 horas si es necesario). botella de cultivo de vez en cuando para observar el crecimiento. Esto hará que las células originales se adhieran a la pared, y mucho menos se expandan y proliferen, especialmente para los principiantes. No hay necesidad de preocuparse por quedarse sin nutrientes en el medio de cultivo y los requerimientos nutricionales antes de la proliferación celular no son muy altos. El propósito de agregar sólo una fina capa de medio de cultivo en las primeras etapas del cultivo primario también es beneficioso para la adhesión y extensión celular.

(7) Tiempo de digestión: Generalmente es suficiente digerir hasta que las pequeñas partículas de tejido sean visibles a simple vista, porque en este momento las partículas de tejido ya están sueltas y se convierten en grupos de células o células individuales con un poco de aire soplando. El tiempo de digestión excesivo a menudo conduce a un mayor daño celular y una reducción de la tasa de supervivencia del cultivo celular.

(8) Otros factores de crecimiento: Después del tratamiento anterior, el cultivo de células primarias aisladas puede tener éxito. Para algunos tipos especiales de células, también se puede considerar agregar algunos factores de crecimiento especiales, como la insulina, que puede promover la absorción de glucosa y aminoácidos por parte de las células. Además, las endotoxinas, el EGF y el FGF pueden promover la mitosis, pero el coste es elevado.