¿Cuánto sabes sobre la tecnología de PCR multiplex?
La sensibilidad analítica (AS) enfatiza el resultado de la prueba: si la muestra contiene la sustancia que se está analizando, ¿cuál es la probabilidad de que la prueba tenga éxito? Si es una reacción de PCR, es el número de copia más bajo que se puede detectar. Una prueba que puede detectar una copia de un patógeno es obviamente más sensible que una que requiere 10.000 copias para dar un resultado positivo.
La sensibilidad clínica (SC) consiste en mirar el problema desde una perspectiva clínica: qué tan exitosos son los resultados experimentales en el diagnóstico de los pacientes.
Si solo hay una causa, no hay diferencia entre la sensibilidad de detección y la sensibilidad clínica. Si el diagnóstico de una enfermedad requiere analizar múltiples causas al mismo tiempo y solo detectar un indicador, no importa cuán alta sea la sensibilidad de detección, la sensibilidad clínica se reducirá considerablemente. No hay duda de que la sensibilidad de detección de qPCR es lo suficientemente buena, pero la sensibilidad clínica no es lo suficientemente buena porque no se puede reutilizar. La sensibilidad clínica de la PCR múltiple es mucho mayor.
La PCR múltiple tiene una importancia clínica importante y amplias perspectivas de aplicación, pero todavía hay muchos factores restrictivos. Entre ellos, la consistencia de la eficiencia de la amplificación por PCR múltiple siempre ha sido el mayor problema, y cuantos más amplicones, mayor. la heterogeneidad Cuanto mayor sea la calidad. En respuesta a los problemas de la PCR multiplex, muchas empresas de I+D biológicas en el mercado tienen sus propias estrategias y ventajas. Según el entendimiento del autor, Shanghai Yonghe Biotechnology utiliza actualmente el software de diseño de cebadores de PCR multiplex desarrollado de forma independiente combinado con tecnología de optimización de PCR multiplex de conocimiento intensivo y utiliza una tecnología única de modificación del conjunto de cebadores para amplificar eficazmente cientos de fragmentos de amplicones en los cebadores. Los cebadores no se pueden emparejar al azar. Los grupos modificados transportados por los cebadores pueden aislar otros cebadores, por lo que se pueden completar más cebadores en un sistema de PCR de un solo tubo. Los grupos modificados desaparecen después de la desnaturalización térmica. Durante el proceso de construcción de la base de datos, los códigos de barras que distinguen las muestras se agregan automáticamente a los extremos de los cebadores, lo que elimina la necesidad de una construcción secundaria de la base de datos.
El Dr. Xiao Junhua, consultor de biotecnología de Yonghe, dijo que la tecnología de PCR múltiple de la compañía tiene un alto grado de uniformidad, ya que el 90% de los amplicones alcanzan 15 lecturas o más; es altamente específica y puede amplificar de manera efectiva; 90% de la secuencia objetivo. Los kits de construcción de bibliotecas que incorporan esta tecnología son adecuados para la construcción de bibliotecas de enriquecimiento en varios instrumentos de secuenciación de alto rendimiento, incluidos los modelos y kits PGM, Miseq e Hiseq. "Nuestra tecnología de PCR multiplex se ha utilizado en diversos servicios técnicos basados en la plataforma cuántica de Qualcomm, como la resecuenciación de secuencia objetivo, los servicios de detección de SNP cuánticos de Qualcomm, los servicios de detección de microsatélites cuánticos (STR/SSR) de Qualcomm, etc."
Diagrama de diseño de cebadores
En la era posgenómica, existe una necesidad cada vez mayor de volver a secuenciar fragmentos del genoma candidatos. La gente se centra más en secuencias que en unos pocos SNP, y los fragmentos candidatos pueden oscilar entre 5 Kb y 100 Kb. El método tradicional de Sanger o la secuenciación de captura por hibridación de la región objetivo es costoso. El uso de secuenciación de captura de la región objetivo por PCR múltiple resuelve bien este problema. La PCR múltiple se utiliza para amplificar toda la región del gen capturada a la vez. En combinación con la tecnología de secuenciación de alto rendimiento, se pueden secuenciar varias muestras simultáneamente, lo que reduce en gran medida los costos al examinar muestras grandes. Este método es adecuado para la detección y el diagnóstico de enfermedades genéticas mendelianas, la resecuenciación de fragmentos candidatos de GWAS, la resecuenciación de fragmentos de mapeo de QTL y la investigación y aplicación de la medicina de precisión.
El servicio de detección de SNP de Qualcomm combina PCR múltiple y tecnología de secuenciación de alto rendimiento para diseñar cebadores específicos para los sitios que se van a detectar, realizar amplificación por PCR múltiple en un solo tubo y distinguir diferentes muestras a través de diferentes cebadores de códigos de barras. Después de mezclar las muestras, los amplicones se secuenciaron en una plataforma de secuenciación. Se utilizan métodos bioinformáticos para distinguir los resultados de la secuenciación y finalmente se obtiene la información SNP de cada sitio. Este método es adecuado para la investigación genética con diferentes fines, como la investigación del genoma de enfermedades, la investigación del genoma de tumores, la investigación de la correlación entre enfermedades y genes, el diagnóstico molecular clínico, etc. En la investigación del genoma de las plantas, se puede utilizar para el mapeo de QTL y el mejoramiento molecular, y es muy adecuado para el análisis de SNP de muestras a gran escala.
En respuesta a la cuestión del precio, el Dr. Xiao dijo que la mayoría de los productos de PCR multiplex de secuencia dirigida en el mercado actualmente utilizan tecnología LM-PCR y kits de PCR mediada por ligadura. Según la investigación de mercado, al construir una biblioteca para LM-PCR, el costo de construcción de una biblioteca es de 300 a 400 yuanes/muestra, mientras que el costo de LM-PCR es de 100 yuanes/muestra.
La PCR multiplex no solo sirve para mejorar la eficiencia o reducir costes, sino que, lo que es más importante, sin multiplexación, el diagnóstico molecular tendrá poca importancia clínica y su aplicación no estará lo suficientemente extendida.
En aplicaciones clínicas, Wing y Bio también han desempeñado más papeles, desarrollando tecnologías que incluyen la detección de sitios relacionados con la eficacia y los efectos secundarios de los medicamentos de quimioterapia, la tipificación del virus de la hepatitis B y la detección de mutaciones YMDD, SNP relacionados con la warfarina. pruebas, pruebas de SNP relacionadas con clopidogrel y otros productos. Además, se han desarrollado y mejorado diversos servicios de tecnología de genética molecular. Las plataformas de servicios más representativas incluyen pruebas de polimorfismo de nucleótido único (SNP) de paso medio-bajo y alto, pruebas de microsatélites de paso medio y alto (STR/SSR), construcción de bases de datos de amplicones de PCR multiplex de segunda generación y resecuenciación dirigida de segunda generación. , detección de diversidad de variación del número de copias (CNV), identificación experimental de antecedentes genéticos de ratones, detección de cuantificación de expresión multigénica (MCF) para identificación celular, detección de microARN y otras plataformas.