Revisión del transcriptoma de 13 EV multiómicos de exosomas: discusión sobre inclusiones de carga y sus proporciones
Además, el ARN en exosomas y vesículas puede servir como biomarcadores no invasivos para muchas enfermedades, incluidos cambios patológicos en el sistema inmunológico.
Esta revisión tiene como objetivo proporcionar la última tecnología en el campo del transcriptoma de ARN relacionado con vehículos eléctricos y analizar exhaustivamente estudios previos utilizando secuenciación NGS para describir el contenido de ARN en vehículos eléctricos liberados por diferentes células. Finalmente, destacamos los desafíos técnicos asociados con la secuenciación profunda de EV puro y ARN asociado a EV.
Las vesículas extracelulares se clasifican según su origen y biogénesis: cuerpos apoptóticos (ABS), microvesículas (MVS) y exosomas.
Los cuerpos tumorales grandes (LO) se han identificado como el cuarto tipo de EV, que son producidos por vesículas de membrana desprendedas por las células tumorales y son similares en tamaño a los AB.
Se diferencian en el diámetro y en su contenido: los MV y los exosomas contienen diversas proteínas citoplasmáticas y de membrana, así como lípidos, carbohidratos y ácidos nucleicos (9), mientras que los AB también pueden contener componentes nucleares y orgánulos.
Diferencias en las características de los marcadores: Los marcadores de proteínas con buenos exosomas incluyen varias proteínas tetraéster, como CD9, CD63, CD 81; Mv contiene proteínas transmembrana que se encuentran comúnmente en la membrana plasmática, como las integrinas y las blancas seleccionadas. AB también se puede distinguir por la presencia de histonas.
En muchas de las primeras tecnologías RT-QCPR y en informes recientes, se han confirmado consistentemente ARNm, miARN y lncARN en exosomas y microvasos. La aplicación de métodos de secuenciación de ARN de paso alto más avanzados ha revelado la presencia de varias otras especies de ARN en subpoblaciones de EV aisladas de fluidos biológicos y medios condicionados por células.
Estos tipos de ARN incluyen SnRNA, snRNA, piRNA, vault RNA, Y-RNA, scRNA, SRP-RNA y 7SK-RNA. y fragmentos cortos de ARNr, ARNt, ARNm, ARNc y varias repeticiones intergénicas.
Tabla 1 | Informe sobre el contenido del transcriptoma EV revelado mediante secuenciación de alto rendimiento
nolte-Thoen et al. estudiaron la liberación de células inmunes durante el cultivo mediante secuenciación de alto rendimiento. ARN pequeño EV. La mayoría del ARN total aislado de los vehículos eléctricos es ARN pequeño (
Además de las proteínas que codifican el ARNm y secuencias repetitivas, los componentes de los vehículos eléctricos también contienen todo tipo de ARN estructural (como vaultRNA, Y-RNA, snRNA, SnRNA , SRP-RNA y tRNA) y fragmentos de lncRNA y pseudogenes.
Además, muchas pequeñas transcripciones no codificantes están enriquecidas en EV en comparación con los ARN celulares, lo que sugiere que las células pueden seleccionar ARN específicos para su liberación extracelular.
Muchos otros estudios también han confirmado que la expresión de los miARN en los exosomas liberados de diversas células cultivadas es significativamente menor que la de otros tipos de ARN. Estos datos son consistentes con observaciones anteriores, es decir, la mayoría de los exosomas lo hacen. no portan copias biológicamente significativas de miARN. Sin embargo, otros experimentos de secuenciación de ARN han demostrado que una proporción significativa de pequeñas lecturas de secuencias de ARN en exosomas liberadas por algunas líneas celulares todavía corresponden a miARN. Curiosamente, varios grupos independientes observaron que 15. -50 del total de fragmentos de ARN leídos coincidían con secuencias repetidas genómicas, incluidas secuencias retrovirales, LTR, SINE y LINE, que los autores no especificaron si el protocolo de preparación de la pequeña biblioteca de ARN utilizado en el estudio anterior incluía modificaciones que permitieran la captura de. 5'-OH y/o ARN 3'-fosforilado.
Por lo tanto, no está claro si realmente caracterizan el espectro completo de ARN pequeños en los vehículos eléctricos correspondientes.
Jenjaroenpun et al. y Miranda et al. informaron la secuenciación de ARN total (incluido ARN largo y ARN pequeño) en medio de cultivo celular MDA-MB y EV en orina, respectivamente, y mostraron una proporción considerable de lecturas de ARNr. (87-97), que es similar al contenido de ARNr en el citoplasma. De los 3 a 13 fragmentos restantes, aproximadamente la mitad se marcaron para transcripciones codificantes de proteínas, mientras que la otra mitad se marcaron para ARN no codificantes y repeticiones genómicas.
En otro informe de Beradrocco et al., los autores utilizaron protocolos de secuenciación de ARN total y ARNs para caracterizar el largo perfil de ARN de los vehículos eléctricos envueltos liberados por cuatro líneas celulares diferentes de cáncer de hígado. La proporción de fragmentos de ARN totales en relación con el ARNr fue la más grande (32-66), mientras que la proporción de repeticiones genómicas fue de 15-44, y solo 11-25 fragmentos se asignaron a genes de ARN codificantes y no codificantes de proteínas. La secuenciación de SRNA de la misma preparación de EV reveló distribuciones ligeramente diferentes de clases de ARN: ARNr (16-54), repeticiones genómicas (24-40) y transcriptoma (24-51).
En otro estudio completo de secuenciación de ARN del transcriptoma en paralelo con la secuenciación de ARN pequeño, Lasser et al. confirmaron que los mastocitos humanos y las líneas celulares de eritroleucemia liberan dos tipos de exosomas (que flotan a través de gradientes de densidad separados en HD). y componentes LD). La aparente falta de correlación entre las cargas de ARN largas y cortas en las fracciones HD y LD sugiere que los ARN extracelulares de estas dos fracciones están asociados con vías diferentes. En comparación con los exosomas de LD, la proporción de lectura de las transcripciones de ARNm fue más abundante en la EH (75 frente a 20), mientras que la distribución de los ARN no codificantes se invirtió (25 frente a 80). En la biblioteca corta de ARN, el miARN maduro (23) está enriquecido en HD, mientras que el ARNt (28) y el miARN maduro (10) están principalmente en LD.
Otro estudio examinó el contenido de ARN de tres tipos diferentes de EV liberados por células de melanoma durante el cultivo y determinó que en cada muestra de EV se enriquecía una cantidad de ARN no codificante. El perfil de ARN mostró picos significativos de ARNr 18S y 28S en AB y MV, con niveles de ARNs relativamente moderados. Por el contrario, los exosomas contienen principalmente ARNr pequeños, más pequeños que los AB y los mv. Aunque la carga de miARN de la subpoblación EV fue ligeramente diferente de la de los exosomas, una gran cantidad de miARN solo se detectó en los exosomas y no en los AB y MV, lo que respalda la idea de que los exosomas están enriquecidos en ARN específicos. Cabe señalar que, en comparación con los miARN, otros tipos de ncRNA no solo se enriquecen significativamente, sino que también se enriquecen selectivamente en diferentes subtipos de EV liberados por las células de melanoma, lo que aumenta la complejidad del estudio de los productos de ARN de vesículas extracelulares y sus funciones.
Hasta la fecha, sólo unos pocos informes han secuenciado pequeñas cargas de ARN en vehículos eléctricos de próxima generación aislados de fluidos biológicos humanos. Estos estudios han demostrado que los exosomas aislados del plasma, la saliva y la orina humanos contienen una proporción significativa de lecturas de miARN (35-76).
Los tipos de ARN restantes en los EV de biofluidos mencionados anteriormente incluyen ARNr, ARNlnc, ARNt, ARNm, regiones repetitivas y pequeños ARN no codificantes como ARNpi, ARNsn, ARNsno, etc. Vale la pena mencionar que, en comparación con los "días" de medios condicionados por células, los exosomas aislados de fluidos biológicos pueden contener grandes cantidades de grandes agregados de proteínas, incluidos complejos AGO cargados de miARN que normalmente están presentes durante la muerte celular. Por lo tanto, aún queda por verificar si los miARN detectados en los fluidos corporales humanos están realmente relacionados con los vehículos eléctricos.
Curiosamente, el ARN total purificado a partir de exosomas urinarios fue secuenciado profundamente y su distribución de transcripción fue completamente diferente a la observada por Cheng et al. Específicamente, la mayoría (~87) de las lecturas de ARN se asignaron a ARNr, solo ~8 se asignaron a ARN no codificantes y repeticiones de ADN, y las 5 restantes correspondieron a ARN codificantes de proteínas.
Por el contrario, las estadísticas del perfil y la distribución de lecturas informadas por Miranda et al. fueron similares a los resultados de la secuenciación de ARN total de exosomas en medios acondicionados con células.
En conjunto, la evidencia colectiva desarrollada a partir de los estudios anteriores (Tabla 1) concluye que los vehículos eléctricos liberados por la mayoría de las células de hecho transportan una gran cantidad de transcripciones no codificantes y transcripciones codificantes de proteínas, así como su sección. , debe tenerse en cuenta al estudiar los efectos del ARN extracelular en las células receptoras.
La diferencia en el contenido de ARN de los vehículos eléctricos puede deberse en parte a: