¿Qué precauciones se deben tomar durante el cultivo celular?
Primero, cultivo primario
(1) Proceso
El proceso básico del cultivo primario incluye la selección del material, la preparación del material de cultivo, la inoculación y el cultivo. Existen muchos métodos para el cultivo primario, los métodos más básicos y comúnmente utilizados son el cultivo en bloques de tejido y el aislamiento celular. 1. El proceso operativo básico del cultivo de tejidos (1)
1), humedezca el material del tejido con una solución de cultivo y use tijeras afiladas para eliminar la grasa y el tejido conectivo adherido. Enjuague con solución equilibrada (PBS) o solución de Hanks; corte el bloque de tejido en trozos pequeños con tijeras curvas oftálmicas afiladas; enjuague con PBS o solución de Hanks varias veces hasta que el líquido ya no esté turbio, sin aceite y transparente.
2) Utilice una pajita húmeda para aspirar los bloques de tejido cortados, soplelos en la botella de cultivo y colóquelos uniformemente a cierta distancia en la pared inferior de la botella de cultivo. El bloque de tejido está adherido a la pared inferior de la botella de cultivo.
3) Voltee la botella de cultivo de manera que el fondo de la botella quede hacia arriba. Agregue suficiente medio de cultivo en el lado opuesto del lado donde. el bloque de tejido se planta de manera que el bloque de tejido no entre en contacto con el medio de cultivo y se aprieta el tapón del frasco;
4) Coloque el lado con el bloque de tejido hacia arriba en una incubadora. a 37°C después de que el bloque de tejido se haya adherido a la pared durante 65438±0h ~ 3h, dé vuelta la botella para permitir que el tejido adherente sumerja el bloque en el medio de cultivo y déjelo reposar; 5) Cambie el medio de cultivo cada 2 a 3 días, o determine el tiempo para cambiar la solución de acuerdo con el cambio de color del frasco de cultivo. 2. Medidas preventivas
1). En los primeros tres días después de la inoculación, la cantidad de células que migran fuera del bloque de tejido es muy pequeña y la adhesión del bloque de tejido no es fuerte. Durante la observación y el movimiento, tenga cuidado de no hacer que el líquido oscile. Se deben evitar girar y vibrar con frecuencia; de lo contrario, los bloques de tejido no se adherirán fácilmente a la pared de la botella o se caerán y flotarán después de colocarlos.
2) No agregue demasiado medio de cultivo para evitar que los bloques de tejido empapados se caigan debido a ligeras fluctuaciones.
3) Cuando utilice bloques de tejido para cultivo, obsérvelos a tiempo. Cuando las células migran, preste atención para registrar y eliminar los trozos de tejido flotante y las células restantes, porque los trozos de tejido flotante y esos fragmentos de células están muertos y las sustancias tóxicas que producen afectarán el crecimiento de las células primarias, por lo que deben eliminarse a tiempo. .
4) Para promover que el bloque de tejido se adhiera a la botella de cultivo lo más rápido posible, se puede aplicar una fina capa de colágeno a la pared inferior de la botella de cultivo antes de plantar. Durante el proceso de cultivo celular, el promotor de adhesión celular en colágeno primero se adsorbe en la pared inferior de la botella de cultivo y luego las células redondas suspendidas se unen a la pared inferior adsorbidas con el promotor de adhesión. 2. Procedimientos operativos básicos para el cultivo de células aisladas: cultivo de células adherentes (1)
1). Primero, utilice el método de dispersión celular para recolectar células. En cualquier momento, tome una pequeña cantidad de jugo digestivo y observe. Se toman medidas para detener la digestión, dependiendo de si el tejido está disperso en grupos de células o en células individuales. Utilice un colador para filtrar los trozos de tejido no digeridos.
2) Centrifugar la suspensión celular a baja velocidad, desechar el sobrenadante, añadir medio de cultivo que contenga suero, soplar suavemente para hacer una suspensión celular, contar y utilizar el medio de cultivo para ajustar la densidad celular.
3) Según el tipo de células cultivadas y los requisitos experimentales, utilice una pipeta para aspirar una cierta cantidad de suspensión celular y agréguela al frasco de cultivo. Para las células que requieren sustratos especiales, aplique el sustrato a la pared inferior del matraz de cultivo antes de inocular las células. 4) Coloque el frasco de cultivo en una incubadora a 37°C para el cultivo.
5) Reemplace el medio de cultivo cada 2-3 días o determine el tiempo de reemplazo en función del cambio de color del medio de cultivo. (2) Notas
1) Aunque las células aisladas en el cultivo primario se dispersan en células individuales cuando entran en contacto por primera vez con el entorno externo, la interacción entre ellas aún existe. Este efecto es muy importante para el. importante la supervivencia de las células. Entre estas células se pueden producir algunas sustancias activas que promueven el crecimiento, lo que permite que las células promuevan la supervivencia y el crecimiento de las demás. Si la densidad de las células sembradas es demasiado baja, el efecto de promover el crecimiento de célula a célula será mínimo. Aunque hay abundantes nutrientes, es difícil para las células adaptarse al proceso de cambio del entorno tisular del cuerpo al entorno de vida independiente después de la dispersión. Si la densidad de las células inoculadas es demasiado alta, provocará un suministro insuficiente de nutrientes y una rápida acumulación de desechos metabólicos, lo que requerirá rehidratación y paso frecuentes.
2) Durante el cultivo primario, cuando los tejidos se dispersan y las células se desprenden, las células pueden sufrir daños graves durante el cultivo inicial. Aumentar adecuadamente la densidad de las células cultivadas primarias y proporcionar más interacciones entre células similares a las in vivo mejorará en gran medida la tasa de supervivencia de las células cultivadas primarias in vitro.
A medida que las células se adaptan al entorno in vitro y se subcultivan, se siembran y cultivan en densidades más bajas.
3) Dado que se rompe la conexión intrínseca entre las células, el entorno de vida de las células aisladas ha cambiado mucho y, en consecuencia, también ha aumentado la dificultad de supervivencia y crecimiento in vitro. Para las células adherentes, hacer que las células sembradas se adhieran al adherente lo más rápido posible es la clave para determinar si el cultivo puede tener éxito. Después de la inoculación, los frascos de cultivo se pueden cultivar en la incubadora durante 3 a 5 horas. Dado que la suspensión celular contiene una pequeña cantidad de líquido de cultivo, las células no solo pueden sobrevivir, sino que también pueden contactar rápidamente con la pared inferior de la botella de cultivo, lo que permite que las células se adhieran rápidamente al sustrato. Después de que las células se adhieran a la pared, se puede reponer el medio de cultivo para continuar con el cultivo.
var script = documento. createelement(' script '); src = '/resource/baichuan/ns '; document.body.appendChild(script); 3. Cultivo celular in vitro: flujo operativo del cultivo celular en suspensión (1)
1) Prepare la suspensión celular, cuente y use medio de cultivo para ajustar la densidad celular. 2) Agregue suficiente medio de cultivo a la placa de Petri. 3) Inocular las células a inocular en el recipiente de cultivo.
4) Coloque la varilla magnética recubierta de PTFE en la placa de Petri. Selle la placa de Petri y colóquela en la incubadora. Incubar mientras se agita en un agitador magnético. Si se inocula en un frasco de cultivo o en un tubo de ensayo, el recipiente de cultivo se puede sellar y fijar en un agitador de temperatura constante y cultivar mientras se agita sin colocar una varilla magnética. Algunas células también se pueden inocular directamente en un recipiente de cultivo previamente recubierto con grasa de silicona y cultivar directamente en una incubadora sin utilizar una varilla magnética, un agitador magnético o un agitador de temperatura constante. 5) Cambiar el medio cuando el medio de cultivo esté ligeramente amarillo. Aspire parte del medio de cultivo antiguo y agregue medio de cultivo nuevo. (2) Precauciones
1) Durante el cultivo en suspensión, las células deben mantenerse suspendidas. Puede ayudar a mantener las células en suspensión aumentando la viscosidad del medio de cultivo, por ejemplo agregando una baja concentración de complejo de ácido hialurónico al medio de cultivo. Se deben agregar al menos 5 ml de medio de cultivo a un recipiente de cultivo con un dispositivo de agitación. De lo contrario, se generarán burbujas durante la agitación y dañarán las células. De esta forma, tenga cuidado de no revolver demasiado rápido, de lo contrario el medio de cultivo se desbordará y provocará contaminación fácilmente. Si la cantidad de medio de cultivo es inferior a 5 ml, se puede utilizar una botella giratoria para el cultivo. Al cambiar el líquido de células en cultivo en suspensión, tenga cuidado de no aspirar las células.
2) Las células que se pueden cultivar en suspensión generalmente tienen una gran vitalidad, una rápida división y proliferación in vitro, un alto consumo de nutrientes y, generalmente, intervalos cortos entre cambios de medio. (2) Precauciones durante el cultivo primario
1. Durante el primer o segundo día del cultivo primario, se debe prestar especial atención para observar si hay contaminación bacteriana y fúngica. Una vez descubierto, debe eliminarse a tiempo para evitar la infección cruzada de otras células;
2 A medida que avanza el proceso de cultivo, los nutrientes del medio de cultivo se consumen gradualmente y cada vez hay menos nutrientes. , y los metabolitos celulares aumentan, el CO2, el ácido láctico, el piruvato y otros productos liberados durante la respiración celular aumentan gradualmente. A medida que aumentan las sustancias ácidas, el valor del pH en la solución de cultivo disminuye cada vez más y el color de la solución de cultivo se vuelve cada vez más amarillo. Por lo tanto, durante el proceso de cultivo celular, se debe prestar atención al cambio de color del medio de cultivo y el tiempo para cambiar el medio debe determinarse en función del color del medio de cultivo. En circunstancias normales, el medio de cultivo es rosado; cuando el medio de cultivo es naranja, las células generalmente crecen bien cuando es de color amarillo claro, puede ser que el tiempo de cultivo sea prolongado, que no haya suficiente nutrición y que haya muchas células muertas; ; cuando es morado, puede ser que las células estén creciendo bien o muertas. Así que succione una porción del medio viejo en el medio ligeramente amarillo y agregue una cantidad igual de medio nuevo. Durante el proceso de cambio de medio, no aspire las células ni deje que el medio de cultivo desborde el frasco de cultivo para evitar la contaminación por diversos microorganismos. Al sustituir el líquido, el medio de cultivo debe precalentarse a 37°C.