¿Cómo realizar experimentos de quinasa y experimentos celulares con el inhibidor de CCR5 Maraviroc?

Quimiocinas e

Inhibición de la unión de CCR5

Medición de células HEK-293 de insecto marcadas con 125I que expresan de manera estable receptores o membranas y sus productos.

MIP-1α,

MIP-1β y

Lantes

en combinación con CCR5. Las células se resuspendieron en tampón de unión a una densidad de 2

×

106

células/ml.

(50

mm

Hepps

incluye 1

mm

Calcio cloruro,

Cinco

mm

Cloruro de magnesio,

y

0,5 BSA [BSA], ajustado a pH =

7,4)

medio. Para preparar las membranas, resuspender las células lavadas con PBS en

tampón Detachment

(20

mm

Heps,

1

mm

Cloruro de calcio,

1

Bloque

Completar

/50

mL,

pH

7,4), luego en Polytron

Agregar un homogeneizador de mano,

40.000 veces

30 minutos, luego suspender en

combinar

En el tampón, la concentración de proteína es 0,25 .

mg/ml

(Cada pocillo de una placa de 96 pocillos contiene

12,5

microgramos

proteína de membrana). Preparación de 125I radiomarcado

MIP-1α,

MIP-1β,

y

Lante

, at

Bind

se diluyó en tampón hasta una concentración final de 400

a las 5 p.m. se añadió Maraviroc a cada pocillo.

Diluyente, el volumen final es 100.

μL,

Las placas se incubaron durante 65.438 ± 0 horas,

mediante bloqueo previo y enjuague

filtros individuales

Filtro en placa, recuento y secado durante la noche.

Test celular:

Clon

Células PBMC o PM-1 estimuladas con PHA

Concentrado

0 - 1

Micra

Tiempo de procesamiento

5 o 7 días

Método

Prueba de sensibilidad al fármaco a 24 pocillos placa de cultivo de tejidos. Se prepararon diluciones seriadas repetidas de 8 puntos de maraviroc en DMSO, siendo la concentración final de DMSO en el experimento 0,1 (vol/vol). Se infectaron células PBMC o PM-1 estimuladas con PHA durante 1 h a 37 °C. Luego, las células se diluyeron una vez, 3,6 veces

×

105

PBMC

o 2,0

×

105

Añadir células PM-1 a la solución diluida.

En cada hoyo de Malawi Rock. La placa de prueba contiene 5 a 37°C.

Dióxido de carbono

(Volumen/Volumen)

Incubar en el ambiente durante 5 días (cepa adaptada de laboratorio) o 7 días (aislado original). Saquinavir se incluyó en todos los experimentos.

(Un

inhibidor de la proteasa del

VIH-1

)

También está Lantes.