Cómo establecer un método de prueba de endotoxinas bacterianas para nuevos medicamentos
[Palabras clave] nuevos medicamentos; prueba de endotoxina bacteriana; prueba de interferencia
[Número de clasificación de la Biblioteca de China] R927.12 [Código de identificación del documento] B [Número de documento] 1673-7210 ( 2011)11(B)-65438.
Cómo establecer un método de prueba de endotoxinas bacterianas para nuevos medicamentos
Xiao Guinan, Sun Qingping, Sheng
Instituto Provincial de Control de Drogas de Guangdong, Guangzhou 510180, China
[Resumen] Propósito: Establecer un método para probar endotoxinas bacterianas en nuevos medicamentos. Métodos: Se utilizó el método del reactivo de Limulus para detectar endotoxinas bacterianas en nuevos fármacos. Resultados: este artículo presenta cómo establecer un método de prueba de endotoxinas bacterianas para nuevos medicamentos, centrándose en cómo determinar los límites de endotoxinas bacterianas y realizar pruebas de interferencia. Conclusión: La inspección de endotoxinas bacterianas proporciona una base útil para el control de calidad y las pruebas de emergencia de nuevos medicamentos.
[Palabras clave] Nuevos medicamentos; prueba de endotoxinas bacterianas; prueba de interferencia
Es una tendencia que los nuevos medicamentos utilicen la prueba de endotoxinas bacterianas para reemplazar la anterior prueba de pirógenos en conejo. lesión por drogas Tiene cierto valor de aplicación en el tratamiento de emergencia y también cumple con los requisitos internacionales para el principio "3R" (optimización, reducción, sustitución) de experimentos con animales. El método actual de detección de endotoxinas bacterianas es la prueba del cangrejo herradura establecida por los científicos estadounidenses Levin y Bang en 1968 [1]. A juzgar por la situación actual de la inspección de endotoxinas, algunas unidades no han podido realizar experimentos y diseños de acuerdo con los requisitos de la Farmacopea China (edición de 2010). Este artículo se centra en la determinación de los límites de endotoxinas bacterianas y las pruebas de interferencia que son propensas a tener problemas durante el establecimiento de métodos de prueba de endotoxinas bacterianas para nuevos medicamentos, en un intento de proporcionar una referencia útil para el control de calidad y la inspección de emergencia de nuevos medicamentos.
1 Confirmación del límite de prueba de endotoxinas bacterianas del nuevo fármaco
La fórmula de cálculo del límite de prueba de endotoxinas bacterianas es 1,1
El límite de prueba de endotoxinas bacterianas ( L) del nuevo fármaco La determinación es la premisa y base de toda la metodología, y generalmente se determina con base en el Apéndice XI E de la Farmacopea China (edición de 2010) [2]. La fórmula de cálculo es L=K/M, donde K es la dosis máxima aceptable de endotoxina por kilogramo de peso corporal humano por hora, EU/(kg?h) significa inyección no radiactiva K=5 EU/(kg?h), inyección radiactiva K=2,5 UE/(kg·h), inyección intratecal K=0,2 UE/(kg·h·m) es la dosis máxima por kilogramo de peso corporal humano por hora. El peso adulto se calcula en 60 kg y la superficie corporal es de 1,62 m2. Cuando las dosis de ciertos medicamentos antitumorales y antibióticos se describen en términos de superficie corporal, la dosis por metro cuadrado de superficie corporal se puede multiplicar por 0,027 para convertirla en una dosis por kilogramo de peso corporal.
1.2 Procedimiento de confirmación de los límites de prueba de endotoxinas bacterianas
En primer lugar, de acuerdo con las instrucciones del nuevo fármaco en estudio, las muestras de prueba se obtienen consultando la última versión del "Instrucciones clínicas de medicación". " y otros materiales autorizados pertinentes. Se calcula la dosis máxima (valor M) para consumo humano por kilogramo de peso corporal por hora, y el valor L. El valor L obtenido se combina con estándares de calidad relevantes (Farmacopea de EE. UU., Farmacopea británica, Formulario de farmacia japonesa, Farmacopea europea) y estándares formalizados o estándares de registro promulgados por la Administración de Drogas y Alimentos de EE. UU.
Otro método es hacer referencia a la dosis de inspección de pirógenos de la especie (puede considerarse como el valor M), porque la dosis de pirógenos generalmente se establece entre 1 y 3 veces la dosis clínica para adultos, lo cual es cercano al factor de seguridad comúnmente utilizado de 3 a 10 veces. Este método de comprobar la dosis en relación con los pirógenos era bastante popular en el pasado, pero ahora se utiliza cada vez con menos frecuencia.
Errores comunes en el cálculo del límite de endotoxinas bacterianas 1.3
1.3.1 Confundir la dosis diaria promedio de un adulto con la dosis máxima. En la mayoría de los casos, las instrucciones o materiales suelen proporcionar sólo una dosis única o diaria del medicamento.
En la práctica, muchas personas suelen confundir una dosis única con la dosis máxima para calcular el límite, y el límite resultante es evidentemente demasiado amplio. Se sabe que, excepto en casos raros (casos agudos y graves), se puede utilizar una dosis única como dosis máxima. En la mayoría de los casos, la dosis diaria se debe convertir a la dosis máxima y se debe considerar un cierto factor de seguridad (generalmente de 3 a 10 veces).
1.3.2 La dosis diaria total se considera erróneamente como la dosis máxima. El tiempo de infusión intravenosa sin considerar la dosis total del fármaco es mucho mayor que 1 hora. Es difícil reflejar verdaderamente el límite real. porque el valor m refleja la dosis diaria del fármaco, la dosis máxima de la muestra de prueba que se puede aceptar por kilogramo de peso corporal por hora, en lugar de la dosis total durante todo el día.
1.3.3 La determinación de los límites de endotoxinas bacterianas para grandes infusiones no tiene en cuenta los requisitos especiales de las grandes infusiones y es demasiado gradual. El componente principal de la infusión a gran escala solo representa una pequeña parte, y la mayor parte es inyección de glucosa o inyección de solución salina normal. Si el límite de endotoxinas bacterianas se calcula en función de los componentes principales, es fácil ser demasiado amplio, por lo que la dosis de prueba de pirógenos de 1,5 UE/ml/kg se utiliza generalmente como dosis clínica máxima, a menos que existan circunstancias especiales.
1.3.4 Ignorar la endotoxina bacteriana exógena introducida por goteo. Algunos medicamentos nuevos se disuelven en grandes infusiones para su uso clínico. Supongamos que la especificación de un antibiótico es 1 g/tableta y su uso debe disolverse en 250 ml de 5 inyecciones de glucosa e instilarse en 1 hora. El límite de endotoxina bacteriana del antibiótico se puede calcular de acuerdo con el siguiente método. 5 UE/(kg?h), por lo que la cantidad máxima aceptable de endotoxina bacteriana por hora para un adulto de 60 kg es 300 UE, mientras que 250 ml de inyección de 5-glucosa pueden aportar hasta 125 UE en 1 hora, y 1 g de la droga que más puede traer Solo puede traer 175 UE (125 ~ 300 UE). Según cálculos convencionales, el límite es 0,300 UE/mg.
1.3.5 En el proceso de determinación de los límites de endotoxinas bacterianas, no se consideran otros ingredientes distintos del fármaco principal, especialmente las materias primas. Por lo tanto, se debe prestar atención a deducir otros ingredientes distintos del fármaco principal (. como iones metálicos: cefotaxima sódica en oxima sódica, sodio en cilastatina sódica), porque las normas generalmente estipulan que el contenido de endotoxinas bacterianas por mg de cefotaxima o cilastatina no debe exceder un número de UE, y las materias primas a menudo contienen otros ingredientes como sodio.
2 Prueba de verificación de sensibilidad del reactivo de Limulus
2.1 Trabajo de preparación
Los instrumentos utilizados en el experimento deben procesarse para eliminar posibles endotoxinas exógenas. Si se utilizan instrumentos de plástico, como microplacas y puntas utilizadas con micromuestras, se deben seleccionar instrumentos que estén libres de endotoxinas y que no interfieran con la detección. Los utensilios resistentes al calor generalmente se eliminan mediante esterilización con calor seco (250 °C, más de 30 minutos). Algunos artículos también se pueden eliminar mediante otros métodos adecuados (como el método de inmersión en ácidos fuertes y álcalis), pero es necesario inspeccionarlos. la prueba de Limulus.
2.2 Prueba de verificación de sensibilidad
Cuando se utiliza un nuevo lote de reactivo de lisado o se produce cualquier cambio en las condiciones de la prueba que pueda afectar los resultados de la prueba, se debe realizar una prueba de verificación de sensibilidad del reactivo de lisado. realizarse. Cabe señalar que solo se puede utilizar para la inspección de endotoxinas bacterianas cuando la sensibilidad medida λc es 0,5λ ~ 2,0λ (donde 0,5λ ~ 2,0λ, λ es el valor indicado de la sensibilidad del reactivo de Limulus. La sensibilidad indicada λ es). La sensibilidad de este lote de reactivo de lisado. En las inspecciones diarias, algunos inspectores utilizan erróneamente la sensibilidad medida como la sensibilidad del reactivo lisado para inspecciones de rutina o pruebas de interferencia.
Prueba de interferencia para la inspección de la prueba Limulus
3.1 Confirmar la dilución efectiva máxima (MVD)
MVD se refiere a la dilución máxima permitida para la solución de prueba en la prueba ¿La fórmula de cálculo es MVD=C? L/λ, donde L es el límite de endotoxinas del producto de prueba, λ es la sensibilidad de etiquetado del reactivo de Limulus (EU/ml), o la concentración de endotoxina más baja en la curva estándar utilizada en el método fotométrico C es la concentración de; la solución de prueba, cuando L se expresa en UE/ml, C es igual a 1,0 si la muestra es un polvo estéril para inyección o API y el MVD es 1, la concentración de dilución efectiva mínima de la muestra se puede calcular como c =; λ/L.
El rango de dilución de concentración efectiva en la prueba de interferencia aquí a menudo se calcula en función del rango de sensibilidad de los principales reactivos de Limulus en el mercado (0,03 ~ 1,00 EU/ml).
3.2 Prueba previa de interferencia
Tomar 1 tableta de este producto (la cantidad de materia prima no es inferior a 10 mg), según el límite de endotoxinas propuesto, disolver la materia prima. o polvo con agua para pruebas de endotoxinas Inyecciones y diluido a una serie de concentraciones que no excedan el MVD especificado, diluya directamente la inyección a una serie de concentraciones que no excedan la concentración de dilución efectiva más baja. En términos generales, se pueden utilizar reactivos LAL con una sensibilidad de 0,125 EU/ml o 0,250 EU/ml para realizar pruebas previas y probar la interferencia de la solución madre y su diluyente en serie (control negativo del producto de prueba, NPC). Además, configure el control positivo (PC), el control negativo (NC) y el control positivo (PPC) de la muestra de prueba y haga dos tubos de ensayo en paralelo para cada concentración. Finalmente, los resultados de la prueba previa de interferencia de la solución de prueba se muestran en la Tabla 1.
Como se puede observar en la Tabla 1, la concentración del producto de prueba no es superior a 20 mg/ml y no interfiere con la inspección de la prueba del cangrejo herradura.
3.3 Prueba de interferencia formal
Prepare cada serie de soluciones de acuerdo con la Tabla 2. La solución de prueba debe ser una solución sin endotoxina detectada y no más de MVD. Consulte las operaciones bajo el elemento de prueba de verificación de sensibilidad del reactivo de Limulus y registre la interferencia de la solución a probar.
Solo cuando los tubos paralelos de la solución de prueba y la solución de control negativo son ambos negativos, y los resultados de las soluciones de la serie de control con la sensibilidad del etiquetado del reactivo LAL están dentro del rango de sensibilidad del reactivo LAL , el lado de prueba es válido y el cálculo La media geométrica (es y Et) de las concentraciones del punto final de la reacción de las soluciones de la serie de control y las soluciones de la serie de reactivos que interfieren con sensibilidad de etiquetado del reactivo de Limulus. Cuando Es es 0,5λ ~ 2,0λ y Et es 0,5Es ~ 2,0Es, se considera que la muestra no tiene interferencias a esta concentración. Si la solución de prueba interfiere con la prueba en una dilución múltiplo menor que el MVD, la solución de prueba debe diluirse aún más para no exceder el MVD y luego se debe repetir la prueba de interferencia.
Las pruebas de interferencia deben realizarse antes de las pruebas de endotoxinas de nuevos medicamentos o al establecer métodos de prueba de endotoxinas para variedades sin elementos de prueba de endotoxinas cuando hay cambios en el reactivo del lisado, la prescripción del producto de prueba, el proceso de producción o las pruebas; ambiente. Si hay algún cambio que pueda afectar los resultados de la prueba, se debe volver a realizar la prueba de interferencia.
4 Métodos para eliminar la interferencia de las soluciones de prueba [3]
4.1 Método de dilución de la muestra
Utilice reactivo lisado de alta sensibilidad para diluir aún más la muestra (por debajo de el factor de dilución efectivo máximo), realice una prueba de interferencia. En términos generales, la mayoría de los efectos de interferencia se pueden controlar eficazmente.
4.2 Método para ajustar el valor de pH
Mida el valor de pH de la solución de prueba si no está dentro del rango de pH del tampón efectivo del reactivo lisado (6,0 ~ 8,0), Se puede seleccionar una cierta concentración de HCl o ajustar el valor de pH a 6,0 ~ 8,0 con NaOH, pero se debe prestar atención a la verificación metodológica (prueba de interferencia) para garantizar que no interfiera con la prueba de Limulus y no tenga impacto en la endotoxina. resultados de la prueba.
4.3 Método de ultrafiltración
A través de un sistema de ultrafiltración dedicado, las impurezas de moléculas pequeñas que afectan la detección de endotoxinas se filtran y los restos de endotoxinas se filtran en el filtro, y la prueba de endotoxinas correspondiente se realiza con agua. Y se evita en la medida de lo posible la interferencia de fármacos de molécula pequeña sin afectar la concentración de endotoxinas.
4.4 Otros métodos
Método de calentamiento por microaislamiento; diluir la muestra con el reactivo de Limulus o una solución antialérgica especial proporcionada por el fabricante para eliminar el factor G (se realiza una prueba de interferencia). requerido en este momento).
5 Inspección de rutina
Utilice la solución de prueba con la dilución máxima efectiva (MVD) y se haya eliminado la interferencia para preparar la solución de prueba y el control positivo para la detección de rutina de endotoxinas bacterianas líquidas. .
6 Discusión
Para establecer un método de prueba de endotoxinas bacterianas para nuevas variedades de medicamentos, el límite de endotoxinas bacterianas debe determinarse en función de la dosis clínica máxima y se deben analizar tres lotes de muestras. utilizando reactivos de Limulus de dos fabricantes. Prueba de Limulus (método de gel ordinario o método de turbidez dinámica).
Si los resultados pueden confirmar que la muestra no tiene interferencia con la prueba de endotoxina bacteriana cuando la concentración no es inferior a la dilución efectiva máxima y el resultado de la prueba de endotoxina bacteriana de rutina de la muestra es negativo, se puede establecer el método de prueba de endotoxina bacteriana para esta especie. [4-7 ]
Según la dosis clínica máxima y los resultados experimentales, el límite de endotoxinas bacterianas del nuevo fármaco en estudio se establece en menos de unos pocos UE por mg (o ml) del fármaco principal. . El experimento de interferencia confirmó que el nuevo fármaco no tiene ningún efecto de interferencia en la prueba de endotoxina bacteriana a una concentración determinada o inferior (pero no inferior a la concentración de dilución efectiva máxima MVC). Se probaron tres lotes de este producto de acuerdo con los estándares propuestos y todos los resultados de las pruebas de endotoxinas cumplieron con las regulaciones.