¿Cómo extraer células de la médula ósea de ratón?

1. Matar a los ratones (ratones C57) por dislocación cervical, remojarlos en alcohol al 75% durante 3-5 minutos, sacarlos y colocarlos en una bandeja esterilizada sobre una mesa limpia.

2. Extraiga los huesos de las extremidades del ratón de forma aséptica, utilice unas pinzas para ojos para sujetar con cuidado la piel abdominal entre las dos articulaciones de la cadera del ratón, utilice tijeras para ojos para cortar con cuidado la piel y separe los dos lados. Separe la piel de cada extremidad inferior, corte hacia abajo en el tobillo y hacia arriba en la articulación de la cadera, de modo que las dos extremidades inferiores del ratón queden libres.

3. Retire con cuidado los músculos, corte el fémur (fémur) y la tibia (tibia) respectivamente, corte el cartílago en ambos extremos y exponga la cavidad medular roja. Preste atención a cortar lo menos posible la cavidad medular. Limpie el músculo sobre el hueso con una gasa.

4. Tome una jeringa estéril de 1 ml, extraiga 1 ml de solución HBSS en cada jeringa y gírela suavemente con una aguja esterilizada. Insértelo suavemente en la cavidad medular, lave la cavidad medular y obtenga la médula ósea. Generalmente, lavando dos veces con 2-3 ml de medio de cultivo, se puede eliminar la mayoría de las células.

5. Filtración: Filtrar con una malla de 200, insertar el centro de la malla en el tubo de centrífuga a 25 px, luego usar una jeringa para absorber el líquido de la médula ósea, inyectar lentamente el líquido de la médula ósea en el centrifugar el tubo a través de la malla y retirar el residuo.

6. Centrifugar: Centrifugar el tubo de centrífuga durante 10 minutos (1350 rpm).

7. Retirar el sobrenadante, añadir 65438±0 ml de lisado de glóbulos rojos ACK, dejar reposar durante 3 minutos, añadir 9 ml de solución HBSS, centrifugar durante 65438±00 minutos y desechar el sobrenadante.

8. Lavar las células de la médula ósea dos veces con solución HBSS y centrifugar a 65438±0350 rpm durante 65438±00 minutos a temperatura ambiente. Cuente las células viables y ajuste la concentración celular a 1X106 células/ml con medio de cultivo.

9. Agregue medio RPMI-1640 al tubo de ensayo, luego agregue 20 ng/ml de citocina GM-CSF, 5 FBS y 0,1 2-mercaptoetanol.

10. Añadir medio de aspiración al sedimento, mezclar bien y cultivar en una placa de 24 pocillos, 65438±0 ml por pocillo.